Способ определения морозостойкости растительных образцов Советский патент 1992 года по МПК A01G7/00 A01H1/04 

Изобретение относится к физиологии растений и микроорганизмов, имеет отношение к консервированию жизнеспособных клеток и тканей, может быть использовано в технической микробиологии, сельском хозяйстве и селекции как метод лабораторного диагностирования морозоустойчивости образцов.

Известны способы установления морозостойкости растительных образцов по состоянию воды и способности клеток к плазмолизу.

Известен способ определения морозостойкости растительных образцов с помощью метода ЯМР-спиновое эхо.

Недостатком известного способа является невозможность установления места локализации льда в клетке, а также необходимость достижения температур, при которых замерзает вода гидратной оболочки.

Цель изобретения - упрощение способа и расширение его функциональных возможностей.

Поставленная цель достигается измерением температурных зависимостей (ТЗ) отношения времен спин-решеточной (Ti) и спин-спиновой (Та) релаксации протонов воды в температурном интервале замерзания свободной воды и по форме кривой судят о месте локализации льда.

На чертеже показан график, отражающий внеклеточную и внутриклеточную кристаллизацию воды.

В жидкостях отношение Ti/Ta 1, а в твердых телах Ti Та. Для биологических объектов из-за анизотропии оно всегда выше единицы. Исследование динамики Тз от- ношения в области кристаллизации свободной воды может дать информацию о месте локализации льда. В клетках, содержащих высокое количество прочносвязан- ной воды, отношение Л/Та после достижения максимума не снижается; в клетках, содержащих высокое количество свободной воды, отношение снижается Данное обстоятельство объясняется тем, что при образовании центров кристаллизасл

с

ч|

со

00

сл о

ции воды вне клетки (в оболочке, в межклетниках, во внеклеточной среде) внутриклеточная вода начинает диффундировать по направлению к месту локализации льда (явление осмоса), снижая тем самым отношение Ti/T2. Таким образом, кривая 2 на чертеже отражает внутриклеточную кристаллизацию воды, а кривая 1 - внеклеточную.

П р и м е р 1. Суспензию Chlorella vulgaris центрифугируют в течение 20 мин при 3000 g и получают биомассу исходной влажности 80%. Биомассу герметизируют в стеклянные ампулы с малым свободным объемом: длина рабочей части 40 мм, внутренний диаметр 8 мм, максимальный объем 2 см3. Ампулу помещают в катушку датчика релаксометра, находящейся в поле постоянного магнита напряженностью 4,9 кЭ. Измерения спада амплитуды спинового эха от протонов воды проводят на установке спинового эха ЯМР, применяемой для импульсных спектрометров типа ЯМР. Для Ti используют программу подачи импульсов 90° - 180° - 90°; для Т2 - 90° - 180°; продвижение строб-импульса автоматическое. Поскольку спад амплитуды эха от протонов воды строго экспоненциален, вычисляют единственное время релаксации длин Ti и Та по формуле

-П.Т2- 2( . In A -In A

где fi, TI - интервалы между импульсами; А , А - амплитуды, соответствующие временным интервалам. Значения амплитуд брались в момент времени 2 г при подаче импульса в момент времени Т.

Термостатирование образцов осуществляли по методике Попла. Градиент температуры внутри образца не превышал ±1°С, точность поддерживаемой температуры ±1°С, образец выдерживался при данной температуре 15 мин. Спад амплитуды спинового эха для TI и Т2 составлял 3-5°. В каждом температурном режиме снимали 4-5 экспонент сигнала спин-эха. Отклонения от среднего значения для времен релаксации не превышали 8-10% (табл. 1).

Времена релаксации и отношение Ti/T2 для хлореллы (влажность 80%) при температурах от 20 до -20°С представлены в табл.1.

На чертеже (кривая 1) и в табл. 1 представлены результаты Т3 отношения Ti/T2

для микроводоросли Chorella vulgaris, которые указывают на внеклеточную локализацию льда при замораживании. Данные работы по электронной микроскопии

Chi.vulgaris после температурного воздействия (при -1,5 и -5°С) подтверждают сделанный вывод. После воздействия указанными температурами в клетках хлореллы наблюдается плазмолиз и деформация клеточной стенки (оболочки).

Однако установленный механизм образования льда в оболочке позволяет при правильно подобранном режиме замораживания получать жизнеспособные клетки.

Пример 2. Суспензию водородоокисляющей бактерии Alcaligenes eutropha z-1 центрифугируют при 5500 g 15 мин и получают биомассу влажностью 75%. Все дальней- шие операции проводят по разработанной схеме (опыт 1). На чертеже (кривая 2) и в табл. 2 приведены экспериментальные данные для Alcaligenes eutropha z-1, которые показывают, что вода замерзает сразу же внутриклеточно; сделанный вывод подтверждают результаты электронной микроскопии.

Времена релаксации и отношение Ti/T2 для бактерии (влажность 75%) при температурах от 20 до -20°С представлены в

табл. 2.

Содержание в клетках бактерий проч- носвязанной воды позволяет применять более жесткие режимы сушки и замораживания.

Предлагаемый способ позволяет устанавливать вне-и внутриклеточную кристаллизацию льда в мелких клетках (бактерии, микроводоросли и др.).

Формула изобретения Способ определения морозостойкости растительных образцов путем анализа состояния воды в клетках методом ЯМР-спиновое эхо, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения функциональных возможностей метода, методом ЯМР-спиновое эхо измеряют температурную зависимость отношения времен

релаксации Ti и Т2 протонов воды в области кристаллизации свободной воды и по форме кривой судят о внутриклеточной или внеклеточной кристаллизации воды, считая морозостойкими образцы в которых

кристаллизация воды происходит внутриклеточно.

Таблица 1

Использование: техническая микробиология, физиология растений и микроорганизмов. Сущность изобретения: производят измерение температурной зависимости отношения времен релаксации Ti и Та протонов воды в области кристаллизации свободной воды и по форме кривой судят о внутриклеточной или внеклеточной кристаллизации воды, считая морозостойкими образцы, в которых кристаллизация воды происходит внутриклеточно. 1 ил., 2 табл.

Таблица 2

#5

8

7

s

5 4 J I

1

Ю

0

49

-20

ion

6