Способ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии и касается экспериментальной оценке типа комбинированного действия (аддитивного потенцирования или антагонизма) малорастворимых токсических пылей на организм, осуществляемой в целях обоснования их гигиенической регламентации при совместном присутствии в воздухе рабочих помещений.

Целью изобретения является повышение воспроизводимости.

Способ осуществляют следующим образом.

Белым крысам одного пола, возраста и близкой массы тела интратрахеально вводят по 1 мл стерильного физиологического раствора или по 1 мл суспензии исследуемых веществ (изолированно либо в комбинации), Комбинации доз подбираются в соответствии с известными принципами планирования двух- факторных экспериментов

Учитывая, что многие показатели реакций альвеолярного фагоцитоза (РАФ) отражают не только прямое повреждающее или стимулирующее действие отложившихся Ъ альвеолярной обсп

С& Ф

О

Ј}

ласти частиц, но и более или менее сложно опосредованные компенсаторные сдвиги, и что зависимость последних от степени токсичности частиц и их дозы носит заведомо нелинейных харак тер, за основу планирования эксперимента принимают двухфакторный эксперимент с тремя уровнями для каждого фактора (матрица плана З2), дающий возможность построить уравнение регрессии

.1

,,

(О

гДе Ъв,Ь ,Ь„ , Ь4,Ъ

J22«bf7

- коэффициенты} X. и Х - дозы факторов (пылей).

Наряду с этим, дополнительная информация может быть получена на том же экспериментальном материале при вычленении из него данных, соответствующих матрице плана 2 , с по- v строением для каждого сочетания уровней факторов уравнений регрессии

(2)

Y +b +bjXj+b X i

При этом в качестве минимального уровня действия каждого фактора принижают отсутствие данной пыли в комби- 30 нации, два других уровня подбирают в предварительных экспериментах таким (образом, чтобы по изучаемым показателям имелось четкое усиление эффекта с увеличением дозы вводимой пылИс, 35 Однако нежелательно, чтобы суммарная доза пылей, вводимая при комбинировании максимальных доз каждой, превышала 10 мг, так как более высокие пылевые нагрузки искажают картину 40 РАФ и ее зависимость от дозьи

Через 24 ч после интратрахеаль- ного введения у крыс под гексеналовым внутрибрюшинным наркозом через надрез в трахее и введенную в него канюлю промывают легкие in situ однократно 10 мл стерильного физиологического раствора (бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), Весь объем извлеченной из легких жидкости за исключением небольшой порции, необходимой для подсчета общего числа клеток в ней обычным меланжерным способом, подвергается центрифугированию при 200 g в течение 4 мин„ Из осадка готовят мазок, который просушивают на воздухе, фиксируют метанолом и окрашивают по Романовскому.

55

45

50

5

10

,

15

20

25

3035 40

м д

При микроскопировании 100-200 клеток с иммерсионным объективом подсчитывают процент альвеолярных макрофагов (AM), нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) и прочих клеток, определяют процент явно дегенерированных AM, измеряют средний диаметр AM, подсчитывают среднее число Фагоцитированных частиц в одном AM и одном НЛ. На основании этих данных рассчитывают отношение НЛ/АМ, абсолютное число НЛ и AM в БАЛ, общее число частиц во всех AM и НЛ, а также их сумму. Наиболее информативными и надежными для характеристики пульмонотоксичного действия пылевых частиц являются показатели общей клеточности, абсолютного числа НЛ, численного соотношения НЛ/АМ,

Для каждого из перечисленных показателей получают значения коэффициентов уравнений регрессии (1) или (2). Статистическая значимость коэффициентов полинома оценивают по критерию t Стьюдента, воспроизводимость данных - по критерию Кохрена, точность аппроксимации - по средней ошибке аппроксимациио Модель считают адекватной, если расчетные показатели укладываются в 95% доверительные интервалы экспериментальных данных„

При анализе уравнений регрессии учитывают не только статистически значимое отличие от нуля значения коэффициента Ь14 и его знак, свидетельствующие о достоверности, степени и знаке отличия эффекта комбинированного воздействия от алгебраической суммы эффектов каждого, а принимают во внимание направленность влияния изолированных факторов на оцениваемый показатель РАФ, Если один из факторов (пылей) увеличивает этот показатель, а другой снижает (т«е„ коэффициенты с индексами 1 и 11 имеют один знак, а с индексами 2 и 22 - другой), то даже при значении коэффициента Ь,, значимо не отличном от нуля, алгебраическое суммирование членов полинома соответствует в токсикологическом понимании антагонистическому действию.

При разных знаках коэффициентов 55 b и Ь (соответственно Ь и Ьц)

преобладает знак линейного члена полинома, если сила соответствующего фактора не превыгаает величину ),

45

50

соответственно Ь„(Ьг2), при большей силе фактора преобразуется знак нелинейного члена, т,е„ в этом случае при разных уровнях и соотношениях доз действие комбинируемых пылей на данный показатель может оказаться как одно-, так и разнонаправленным,,

Кроме того, принимают во внимание характер и фи-зиологический (или токсикологический) смысл данного показателя. Например, если среднее число пылевых частиц в единичном AM при комбинированной пылевой нагрузке значимо выше алгебраической суммы влияний изолированных факторов на это показатель (т.е0 коэффициент Ь12 статистически значимо больше нуля), то это свидетельствует о взаимном ослаблении цитотоксического действия частиц, т.е0 не о потенцировании, а об антагонизме„

С учетом указанного определяют, по каким показателям РАФ имеет место аддитивный тип комбинированного действия, по каким - более аддитивного (потенцирование), по каким - менее аддитивного (антагонизм) или явная противонаправленность действия. При выборе основного типа действия (в соответствии с определением этого понятия методическими рекомендациями МЗ СССР № 40-50-85) учитываются встречается ли это т тип по наибольшему числу показателей РАФ и/или при наибольшем числе вариантов доз, а также насколько токсикологически значимы эти показатели. Отдают предпочтение тому типу действия, который выявлен по показателям РАФ, перечисленным в качестве наиболее информативных. Вместе с тем при трактовке уравнений регрессии с учетом сделанных указаний несовпадение оценок по разным показателям РАФ является достаточно редким.

П р и м е р0 Результаты эксперимента, проведенного с частицами двуокиси марганца и хромата бария, растертых до близкой дисперсности, соответствующей обычному распределению частиц по размерам в производственных аэрозолях дезинтеграции. Для обоих веществ взяты уровни до 2,5 и 5,0 на крысу. Эксперимент в девяти вариантах комбинирования, соответствующих плану матрицу 3 , проведен в шести повторностях (т.ес в сумме на 54 животных) „ Критерию воспроизводимости

уравнение регрессии (1) отвечало по шести показателям РАФ: общая клеточ- ность БАЛ, абсолютные числа AM и НЛ, коэффициент НЛ/АМ, средний диаметр AM, общее число фагоцитированных частиц во всех AM и НЛ0

Для всех показателей, информативных с точки зрения оценки пульмонотоксического действия, вклад фактора X (соответствующего двуокиси марганца) выше вклада фактораXj (хромата бария), что дает согласованную оценку первой пыли как более токсичной, о том же свидетельствует и сравнение групп, получивших равные дозы той или иной пыли, по показателю процента дегенерированных AM, По всем шести показателям, кроме последнего, анализ полинома (1) выявляет либо противонаправленность эффектов, либо комбинированный эффект менее аддитивного для любых или преобладающих сочетаний доз, По последнему из

указанных показателей положительный коэффициент b также отражает, комбинированный токсический эффект менее аддитивного. Значения коэффициентов полинома для шести показателей приводятся в таблице,

В качестве примера явной противонаправленное ти действия хрома и марганца, дополнительно усиливаемой отрицательным значением коэффициента b fi, можно привести уравнение регрессии для среднего диаметра AM

,3+3,75X1+0,,75X,r 0, 22x1-0,25 (мкм).

Следующее уравнение регрессии (для общей клеточности БАЛ) приводится как пример комбинированного эффекта менее аддитивного при однонаправ- ленности действия факторов (противонаправленное действие фактора Х, т.е. двуокиси марганца, может проявиться только при дозе более чем 1,34:0, мг, которая заведомо значительно выше допустимой при интра- трахеальном введении и в расчет может не приниматься).

Ґ(4,0)+0,1чХ 0, ,34Хг -0,,) -10 6 (клет) .

Как по тем же телям РАФ, так и

самым шести показа- еще по семи другим. .(среднее число частиц в одном AM, то

же, в одном НЛ, соответствующая сумма частиц во всех AM, то же, во всех НЛ, процент АК, процент НЛ, процент дегенерированных AM) получены уравнения регрессии (2), отвечающие условиям адекватности и воспроизводимой ти. Так как отличные от нуля уровни воздействия комбинировались в четырех дозовых сочетаниях, то это да- ет в общей сложности 52 уравнения. При этом тэлыс о восемь из них свидетельствуют о возможности комбинированного действия более аддитивного, в OCT-JU 1-ных 44 случаях - явный антагонизм (противонаправленность эффектов) или действие менее аддитивного, причем отличие от аддитивности в большинстве этих случаев статистически значимо.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность дополнить комплекс методов ускоренной экспериментальной оценки типа комбинированного действия химических в еще с тв новымметодом, адекватным задаче такой оценки в случае малорастворимых токсичных пыпей, для которого она наименее разработана в целом; сочетать специальное исследова Гниетого, как проявляется комбинирован- ное действие на уровне реакции альвеолярного фагоцитоза (имеющей важнейшее значение для прогнозирования ток- сикокинетических особенностей комбинированного действия малорастворимых пылевых частиц, а также пульмоноток- сичности такой комбинации с возможностями ускоренного прогнозирования основного типа комбинированного ре- зорбтивно-токсического действия на организм в целом.

Способ основан на простых и хорошо воспроизводимых цитологических

5

0

Q

5 0 -эг 40

показателях и не требует дорогостоящего оборудования, а использование методов математического планирования сводит к минимуму расход, животных. Способ сочетает свойственную клеточным тестам более широкую биологическую обобщенность оценки и высокую статистическую надежность показателей, получаемых при подсчете сотен клеточных элементов, с учетом реакции целостного организма на цитотоксичес- кое действие пылевых частиц.

Использование изобретения позволяет сократить время исследования до одной недели (вместо 4 мес в известном способе), снизить трудоемкость и повысить точность оценки типа комбинированного действия малорастворимых пылей.

Формула изобретения

Способ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей путем введения в легкие экспериментального животного исследуемых пылей с последующим излучением ответной реакции организма, отличающийся тем, что с целью повышения воспроизводимости, исследуемые,пыли вводят интра- трахеально и через 24 ч проводят брон- хоальвеолярный лаваж, центрифугируют и затем микроскопируют клеточный осадок, исследуют цитологические показатели реакции альвеолярного фагоцитоза для построения уравнений регрессии этих показателей/по дозам, входящим в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 75% исследованных показателей.

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии, и может быть использовано при оценке типа комбинированного действия малорастворимых токсических пылей на организм. Цель - повышение воспроизводимости. Белым крысам интратрахеально вводят по 1 мл суспензии исследуемых веществ, через 24 ч под гексеналовым наркозом проводят рассечение трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и подсчет альвеолярных макрофагов, нейтрофилов. Затем строят уравнение регрессии по дозам входящих в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 75% исследуемых показателей.

Показатель РАФ

Коэффициенты

Общая клеточ- ность х 10 Число AM x 10 Число НЛ х 10 НЛ/АМ

Средний диаметр AM, мкм Общее число фагоцитированных частиц в БАЛ х 10

ьо Ц J V Ъг Т

4,01 1,43 1,32 1,74

39,3

26,6

0,19 0,011 -0,26 -0,011

3,75

9,85

0,06

-0,005

0,5А

0,19

0,51

1,34

-0,016

0,99

0,58

-2,75

-0,02

-0,007

-0,08

0,14

-0,22

-1,10 10,25

-0,67

11

1,34

-0,016

0,99

0,58

-2,75

-0,02

-0,007

-0,08

0,14

-0,79 -0,03 -0,56 -0,07

-0,22 -0,25

-1,10 10,25

-0,67

0,65