Штамм ротавируса мышей, для получения диагностических препаратов Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

сл

с

Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения - штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов. Штамм получил название ЕДС и депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского под номером ГКВ N2113. Штамм используют в качестве ротавирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический диагностикум для иммунологических реакций.

Изобретение относится к области вирусологии.

Целью изобретения является штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов.

Штамм ротавируса мышей выделен от больных инбредных 7-12-дневных мышей- сосунов линии BAL В/с из кишечника, селезенки и печени во время вспышки эпизоотической диареи молодых мышей (EDIM) в питомнике лабораторных животных в 1983 г. Выделенный штамм получил наименование EDC - по первым двум буквам названия болезни EDIM и символа С, указывающего на линию мышей BAL В/с, ставшую источником выделения вируса.

Штамм прошел в лаборатории 21 пассаж через организм 5-7-дневных мышей линии BALB/c.

Штамм EDC ротавируса мышей депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ № 2113.

Штамм EDC ротавируса мышей характеризуется следующими признаками.

Физико-химические свойства. Вирус является РНК-содержащим. Устойчив к воздействию этилового эфира при 4-5°С в течение 20 ч, хлороформа при 18-20°С в течение 1 ч, дезоксихолата натрия в концентрации 1:500 при 37±1°С в течение 1 ч, фреона 113 при 18-20°С в течение 1 ч, трипсина 0,25%-ного при 37±1°С в течение 2 ч. Устойчивость к жирорастворителям свидетельствует о том,что вирус не содержит липидосодержащей оболочки. Вирус не ингибируется средами со значениями рН 2,5-12,0 при 4-5°С в течение 2,5 ч. Термоустойчив к прогреванию при 37-60°С в течение 1 ч и в присутствии 1 М MgCl2 при 50°С

сл ч|

о

О

о

в течение 1 ч, при 70°С в течение 30 мин. Вирус устойчив к глутаровому альдегиду в 0,3-0,5%-ной концентрации при 22-23°С в течение 4 ч. Вирус инактивируется при использовании 0,5%-ного раствора глутарово- го альдегида через 24 ч и 1 %-ного раствора и через 0,5 ч.

Биологические свойства. Патогенен для животных, вызывает инфекцию у нелинейных и линейных 2-10-дневных мышей-сосунов линий BAL В/с, A/Sn, CBA и гибридов Fl (CBAxC57BL/6) при пероральном заражении. Инкубационный период 1,5-3 сут. Признаки болезни у сосунов проявляются вздутием живота, переполнением желудка, острым энтеритом, некоторым замедлением роста, при осложнениях развиваются копростазы, приводящие к смерти животных от кишечной непроходимости.

Взрослые самки, вскармливающие больных сосунов, не имеют видимых изменений во внутренних органах, но являются вирусоносителями и у них обнаруживается вирусспецифический антиген в паренхиматозных органах.

Передача вируса. Вирус передается фе- кально-оральным путем.

Контагиозность. Вызываемое вирусом заболевание контагиозно для мышей.

Репродукционная способность. Вирус обладает высокой репродукционной активностью. Репродукция вируса проходит в цитоплазме. Инфекционный титр вируса для мышей-сосунов при пероральном заражении достигает 108-10105 ИД 50/0,1 мл.

Иммуногенность. Вызывает образование вирусспецифических антител, включая преципитирующих, при иммунизации кроликов и у мышей-реконвалесцентов.

Антигенные свойства. Выявляют антигенное родство штамма EDC ротавируса мышей с ротавирусами обезьян (штамм SA II) и телят (штамм РМ) при идентификации его по непрямому методу иммунофлуорес- ценции (ИФ), в реакции диффузионной преципитации в агаре (РДПА) и по методу иммуноферментного анализа. Штамм EDC в испытаниях по ИФ не имеет связи с вирусами гепатита мышей, лимфоцитарного хо- риоменингита, осповакцины, эктромелии, Сендай.

На основании физико-химических, биологических и антигенных свойств выделенный штамм вируса классифицируют и относят к семейству Реовириде, роду Рота- вирус.

Выявление свойства полученного штамма EDC в отношении его высокой устойчивости к повышенной температуре, липи- дорастворителям, изменениям РН среды в

широком диапазоне обеспечивают штамму способность выдерживать режимы обработки и очистки вируссодержащего материала от балластных белковых веществ и нежелательных контаминантов во время изготовления диагностических препаратов - ротавирусного антигена, диагностикума и специфических сывороток.

П р и м е р 1. Получение антигена и

0 вирусспецифического диагностикума к ро- тавирусной диарее мышей.

Штамм EDC размножают путем заража- ния per os 5-7-дневных мышей линии BAL В/с. Через 5-8 дней после инфицирования

5 на высоте клинического проявления заболевания мышей забивают под эфирным наркозом, извлекают кишечник (и отдельно печень с селезенкой) и измельчают в гомогенизаторе или ступке, затем готовят 20%0 ную суспензию на физиологическом растворе с добавлением антибиотиков широкого спектра действия, например канами- цина и гентамицина 100-200 ед/мл. Суспензию выдерживают 2-2,5 ч при 4°С,

5 центрифугируют при 3000 - 3500 об/мин в течение 30 мин и подвергают очистке фреоном. С этой целью вируссодержащую суспензию смешивают в равных объемных отношениях (1:1) с фреоном 113 и встряхи0 вают на шуттель-аппарате в течение 1,5-2 ч при 20-25°С для извлечения фреоном из суспензии балластных белковых веществ. Для последующей очистки суспензии и удаления фреона смесь центрифугируют при 3000 5 3500 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость контролируют на стерильность и используют в качестве рота- вирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический

0 диагностикум для иимунологической реакции диффузионной преципитации (РДПА).

Для иммунизации животных используют ротавирусный антиген, изготовленный из кишечника. Для иммунологиче5 ских реакций в качестве диагностикума используют как суспензии кишечника, так и суспензии печени с селезенкой, обработанные по указанному способу.

В целях длительного сохранения рота0 вирусного диагностикума очищенную надосадочную жидкость соединяют с 4%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в объемном соотношении 1:1, разливают по 0,5 мл в вакуумные ампулы, подвергают

5 вакуумной лиофильной сушке и используют в реакции диффузионной преципитации в агаре.

П р и м е р 2. Получение гипериммунной диагностической сыворотки к штамму EDC ротавируса мышей.

Диагностическую сыворотку получают путем иммунизации кроликов очищенным ротавирусом мышей, полученным из суспензии кишечника после обработки фреоном 113 в последовательности выполнения операций, как в примере 1. Для иммунизации используют кроликов породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг.

Очищенный вирус смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и после получения эмульсии вводят кролику в область подколенного лимфоузла в объеме 1 мл и 1 мл в 10-12 точек внутрикожно в область спины. После 4- или 6-недельного перерыва проводят реиммунизацию вирусом с неполным адъювантом в соотношении 1:1 в подколенную область в объеме 1 мл и 1 мл в 12-15 точек внутрикожно в область спины. Спустя 7-10 дней после реиммуниза- ции производят забор крови из ушной вены кроликов.

Активность полученной из крови сыворотки определяют непрямым методом ИФ и в РДПА. При получении активных сывороток производят дробное кровопускание в сроки до 20-го дня после реиммунизации.

Титры специфических антител гипериммунной диагностической сыворотки в ИФ 1:64, преципитирующих антител в РДПА 1:32- 1:64.

П р и м е р 3. Обнаружение антигена (ротавируса мышей) в мазках-отпечатках из патологического материала непрямой им- мунофлуоресценцией.

Для исследования методом иммунофлу- оресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из кишечника, селезенки и печени инфицированных вирусом мышей. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них диагностическую гипериммунную кроличью сыворотку в рабочем разведении, помещают во влажную камеру, затем промывают фос- фатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают. Затем наносят флуоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика и обработку препарата повторяют указанными методом. Приготовленные препараты исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на сероватом фоне свече- ния тканей органов. Исследование препаратов в ИФ сопровождается постановкой контролей с использованием гетеро- логичных и отрицательных сывороток. В качестве гетерологичных сывороток могут служить сыворотки против вируса гепатита мышей, Сендай, осповакцины, лимфоцитарного хориоменингита и др. Отрицательную сыворотку получают из крови здоровых мышей.

С использованием гипериммунной сы- 5 воротки по методу иммунофлуоресценции проводят лабораторную диагностику рота- вирусной диареи мышей во время вспышек кишечных заболеваний в питомниках и вивариях и при исследовании эксперимен0 тально зараженных животных.

П р и м е р 4. Определение антигена (ротавируса мышей) в патологическом материале и антител в сыворотках .крови с помощью реакции диффузионной преципи5 тации в агаре.

Испытуемым материалом служат 5%- ная суспензия кишечника, печени, селезенки или фекалий на фосфатно-буферном растворе от экспериментально зараженных

0 и естественно больных мышей, а также сыворотки крови реконвалесцентов. Реакцию ставят в чашках Петри с агаровым покрытием, в котором делают лунки в виде звеньев, состоящих из 6 лунок по перифении и одной

5 центральной в каждом звене.

Для обнаружения антигена ротавируса мышей в исследуемом материале в центральную лунку вносят диагностическую пре- ципитирующую сыворотку в рабочем

0 разведении, две диаметральные лунки заполняют заведомо положительным ротави- русным антигеном в рабочем разведении, в остальные вносят испытуемый материал. Для обнаружения антител в централь5 ную лунку вносят вирусспецифический ро- тавирусный диагностикум, в верхнюю лунку наливают положительную преципитирую- щую сыворотку к ротавирусу мышей, в остальные вносят испытуемые сыворотки.

0Полученная специфическая диагностическая сыворотка при иммунопреципитации с антигеном ротавируса мышей, а ротави- русный диагкостикум при взаимодействии с антителами к ротавирусу мышей вызывает

5 образование линий преципитации в агаре. Проведенные в РДПА испытания дали положительные результаты при исследовании мышей с экспериментальной и естественной ротавирусной инфекцией.

0При сопоставлении результатов, полученных с помощью методов ИФ и РДПА, выявляют корреляцию данных. Метод РДПА уступает по чувствительности тесту ИФ в 2-4 раза, но более удобен при массовом контро5 ле лабораторных животных, так как позволяет исследовать большее количество проб в единицу времени. Кроме того, установление этиологии заболевания с помощью метода РДПА проще в исполнении по сравнению с ИФ и может быть осуществле

но на базе неспециализированной диагно-Формула изобретения

стической лаборатории практического про-Штамм ротавируса мышей ГКВ № 2113

филя в непосредственной близости от очагадля получения диагностических препараинфекции.тов,