ШТАММ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК Российский патент 1995 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к медицине, в частности, к диагностике и профилактике заболеваний, вызванных ротавирусами (РВ).

Известны эталонные штаммы РВ человека (РВЧ), выделенные за рубежом: Wa (1 серотип), DS-1 (2 серотип), ITO (3 серотип), St4 (4 серотип) 69М (5 серотип), W161 (6 серотип) и др. (I). Однако РВ относится к труднокультивируемым агентам, поэтому как культивирование штаммов, так и выделение вирусов от больных остается сложной задачей, недоступной для многих лабораторий.

До сих пор в стране для создания диагностических препаратов используют РВ животных: NCDV - теленка, SA-11 - обезьян и OSU - свиней. Однако для профилактики ротавирусной инфекции (РВИ) штаммы животного происхождения непригодны, так как не стимулируют выработку антител к поверхностным антигенам РВ человека, отвечающим за вируснейтрализующую активность.

Для профилактики РВИ предпочтительно использовать РВ человека. Отсутствие высокорепродуктивных штаммов РВЧ тормозит развитие работ в этом направлении. Обнаружена изменчивость на уровне генома штаммов РВ в ходе циркуляции их среди населения, которая по аналогии с вирусом гриппа охарактеризована как явление антигенного дрейфа. Поэтому представляется целесообразным использовать для разработки профилактических препаратов актуальные по антигенной характеристике эпидемические штаммы РВЧ.

Целью изобретения является высокорепродуктивный адаптированный к различным клеточным культурам штамм РВЧ - продуцент высокоактивной специфической сыворотки животных (для диагностики) и лактосыворотки коров (для профилактики) РВИ.

Предлагаемый штамм выделен в ЛенНИИЭМ им.Пастера, депонирован в Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2288.

Штамм РВЧ 568 выделен в 1988 г. от больного острым гастроэнтеритом ребенка в возрасте 1 г 10 мес в первые дни болезни при заражении культуры клеток МА-104.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология типична для ротавирусов.

Чувствителен к различным культурам клеток животного и человеческого происхождения: перевиваемым - MA-104, gMK, RK-13, СПЭВ, первично-трипсинизированным (клетки почки кролика и человека), диплоидным (клетки человеческого легкого - ДКЧЛ и легкого эмбриона коровы - ЛЭК). Штамм 568 активно репродуцируется в указанных культурах клеток при 37^оС в стационарных и роллерных условиях, вызывает цитопатогенное действие (ЦПД) с полной деструкцией клеток через 18-48 ч. Необходимым условием культивирования является предварительная обработка вирусной суспензии раствором трипсина (10 мкг/мл) за 15 мин до заражения клеток, отмытых от ростовой среды раствором Хенкса.

Титр вируса достигает 5,5-6,0 lgТЦД₅₀/мл в культуре клеток gМК, выращенной в стационарных условиях на среде игла с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота и 1% эмбриональной сыворотки коров.

Геном РВЧ 568 содержит 11 сегментов РНК, состоящих из 4 групп: 1 группа - 4 сегмента, 2 - 2 сегмента, 3 - 2 сегмента (8, 9 сегменты мигрируют слитно), 4 - 2 сегмента. По профилю сегментов РНК штамм относится к группе А, по длине пробега - к подгруппе II ("длинногеномный"). Штаммы подобного электрофоретипа доминировали среди вирусов, выделенных от больных ОКИ детей в Ленинграде в 1988-90 гг. Штамм РВЧ 568 в процессе культивирования в лабораторных условиях на уровне 15-ти пассажей обнаружил стабильные свойства генома - профиль РНК его не изменился.

Пример использования штамма для получения сывороток животных.

Иммунизацию кроликов массой 2,0-2,5 кг проводят в 2 цикла: I цикл - иммунизируют концентрированным очищенным вирусом с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ): 0,5 мл вируса и 0,5 мл ПАФ вводят в/м вблизи подколенного лимфоузла. II цикл - через 21 день иммунизацию проводят осветленным неконцентрированным вирусом. Один раз в неделю в течение 3 недель вводят 5,0 мл вируса без адъюванта в/в или в/м. Через 10 дней после последней инъекции берется кровь на исследование. Активность сыворотки определяется методом ИФА. Использование предложенной схемы иммунизации позволяет получить сыворотки с титром антител 1:12,5-1:25 тыс.

Иммунизация морских свинок проводится также в 2 цикла.

I цикл 1) 0,3 мл концентрированного очищенного вируса и 0,3 мл ПАФ вводят в/м в левую заднюю ногу; 2) через 5 дней то же количество вируса с ПАФ вводят в правую заднюю ногу.

II цикл - через 21 день иммунизацию проводят неконцентрированным вирусом без адъюванта. 1) 0,05 мл вируса вводят п/к, через 3-4 ч - 0,5 мл вируса вводят внутрибрюшинно; 2) через 1 день - 0,75 мл вируса в/бр., 3) через 1 день - 1,0 мл вируса в/бр. Через 10 дней обескровливают животных и определяют титр антител в сыворотке методом ИФА. Указанная схема позволяет получить высокоактивные сыворотки с титром 1:50 - 1:100 тыс.

Гипериммунные сыворотки животных используют для выделения специфических антиротавирусных 1gG для получения тест-системы иммуноферментной для обнаружения ротавирусного антигена.

Иммунизация коров с целью сбора иммунного молока, содержащего антитела к ротавирусу человека проводится за месяц до отела - 4-кратно: 1) очищенный концентрированный вирус вводят с адъювантом гидроокисью алюминия из расчета 3 ч. вируса - 1 ч. AL(OH)₃: 5,0 мл смеси в/м; 2) через 7 дней - 5,0 мл смеси неконцентрированного вируса с адъювантом - в/м; 3) через 7 дней - то же самое. 4) На последнем этапе перед отелом вводят внутривыменно 1,0 мл концентрированного очищенного вируса без адъюванта. Затем в течение 5-7 дней собирают молоко, определяют активность методом ИФА. Предложенный способ иммунизации дает возможность получить иммунное молоко с титром антител 1: 12,5-1: 25 тыс. Последующее приготовление препаратов лактосывороток проводится общеизвестными методами.

Использование: медицина, в частности диагностика и профилактика заболеваний, вызываемых ротавирусами. Сущность изобретения: предлагается штамм ротавируса человека (РВЧ) - продуцент высокоактивной специфической сыворотки животных (для диагностики) и лактосыворотки коров (для профилактики ротавирусной инфекции. Штамм РВЧ 568 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2288. Предлагаемый штамм выделен от больного острым гастроэнтеритом ребенка; адаптирован к различным первычным и перевиваемым клеточным культурам; характеризуется высокой репродуктивной активностью с проявлением ЦПД с полной деструкцией клеток через 18 - 48 ч и высокими иммуногенными свойствами. Штамм стабилен в лабораторных условиях при культивированнии на уровне 15-ти пассажей. Использование штамма для иммунизации животных (морских свинок, кроликов, коров) дает возможность получения высокоактивных специфических сывороток.

ШТАММ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК.

Штамм ротавируса человека ГКВ N 2288 для получения диагностических и профилактических сывороток.