Способ нанесения водонерастворимого биоцида на поверхность гидрогелевой подложки Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/00 C12M1/00 

Изобретение относится к иопыта- ниям материалов на устойчивость к воздействию микроорганизмов и может быть применено при определении эффективности биоцидов и других работах, связанных с равномерным нанесением биоцидов на поверхность материалов изделий и питательных сред.

Цель изобретения - более полное нанесение биоцида на подложку.

Готовят раствор водонераствори- - мого биоцида в органическом растворителе. Биоцид осаждают путем испареьня растворителя на дно горизонтально (по уровню) установленного сосуда и синтеэчруют гепеобраэную подложку непосредственно на осажденном биоцнпе или заливают расплавленную агаровую среду. Для нанесения биопила на агаровую питательн- го среду сосуд должен быть выполнен из фторопласта. В случае гидрогелевой подложки, синтезируемой пол ериза- цией или поликонденсацией моноМеров, сд)суд может быть выполнен из стекла. Пластинку агаровой среды переворачивают так, чтобы наверху была поверх

ность с биоцидом, гелеобразную подложку помещают на питательную среду, стерилизуют и засевают спорами микроскопических грибов и определяют . лаг-период роста и биомассу.

Примеры конкретного применения способа нанесения водонерастворимого биоцида на поверхность гелеобразующий подложки.| О

Пример 1, Для осаждения водонерастворимого биоцида - биоцина, представляющего собой смесь двойной цинковой соли этиленбисдитиокарбо- 5 аминовой кислоты и метилового эфира- -№ бензилимидОэолин-2-карбоаминовой кислоты, на гидрогелевую подложку с концентрацией) например, t 1, моль/смй, готовят раствор 20 биоцина в хлороформе молярной концентрацией моль/дм5. В стеклянную чашку Петри внутренним диаметром 100 мм заливают 5 смэ раствора и ставят ее на полку термостата, уста- 25 новленную строго горизонтально по уровню. В термостате устанавливают температуру 55°С и проводят испарение растворителя до постоянного Beca чашки Петри с осажденным биоцином. 30 После этого подготавливают состав .для синтеза гидрогелевой подложки, для чего в стеклянный стакан вместимостью 150 см заливают 70 смэ дистиллированной воды, загружают ту- 5 да 70 ы перекиси бензоила, 30 сма этиленгликольмонокгтакрилата и 1,5 См этилентликольдиметакрилата. Смесь тщательно перемешивают и 40 см3 смеси заливают в чашку Петри, на дно 40 которой, как указано выше,осажден равномерный слой водонерастворимого биоцида биоцина. После этого чашку Петри со смесью помещают в термостат, полки которого устанавли- Д5 вают строго горизонтально по уровню и ведут полимеризацию смеси при 90°С в течение 2 ч. По окончании полимеризации чашку Петри с содержимым вынимают из термостата, охлаждают до eg комнатной температуры и извлекают заполимеризованную подложку с приставшей к ней равномерной пленкой биодана. Подложку десятикратно отмывают дистиллированной водой от мономера, димера и перекиси бензо- кла. Полноту отмывки контролируют спектрометрически при длине волны 220 нм.

55

Остаток биоцина1 .в чашке Петри после извлечения подложки определяют путем отмывки чашки Петри хлороформом, испарением его до постоянного веса и последующим гравиметрическим определением остатка. Исследования показывают, что остаток биоцина11 не превышает 0,0004 г (в пределах ошибки измерения). Равномерность распределения биоцида на поверхности гидрогеля оценивают следующим образом. Специальным штапом-ножом вырезают из подложки с нанесенным биоцидом 5-6 цилиндрических образцов диаметром 2 см и экстрагируют с поверхности образца. Растворение проводят в Течение 1,5 ч при 40-50°С. Концентрацию биоцида в растворе определяют спек трометрическим методом в УФ-обла- сти спектра при 220 нм,

Концентрацию биоцина на 1 см поверхности пЪдложки (cs) рассчитывают по формуле:

а

.

1000 S

где Су - молярная концентрация биоцина в растворе хлороформа, моль/дм ; S - площадь дна чашки Петри

диаметром 100 мм,смс. Подставив в формулу значения Су и S из опыта, получают

„ ,57ЧОГв . .n-ft , а С 1 1° моль/см

Равномерность распределения биоцина и его концентрация на поверхности подложки составляют 1 10 ± i 1,(Гв моль/смй (табл.1).

Промытые гидрогелевые подложки помещают в чашки Петри биоцидным слоем кверху, стерилизуют, устанавливая их в боксы под ртутными или ртутно-кварцевыми лампами на расстоянии см с выдержкой в этих условиях 4,OtO,1 ч. «

В дальнейшем гидрогелевые подложки с осажденными на них различными концентрациями биоцина11 в моль/см используют для определения его био- цидной эффективности по лаг-фаве и кинетическим параметрам развития грибов видов: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ter- reus, Chaetomium globosum, Paecilo- rayces yatioti, Penicillium funicu

51

losutn, Penicillium chrysogemm.P.eni- cillium cyclopium, Txichodemia vi- ride.

Испытания биоцидной эффективности биоцина проводят на гидрогелевых подложках с осажденным на них водо- нерастворимым биоцином 1 различных поверхностных концентраций. Для этого в стерилизованные чашки Петри заливают среду Чапека-Докса и укладывают в них гидрогелевые подложки так, чтобы поверхность подложки,свободная от биоцида, контактировала с питательной средой, а на поверхность, со держащую биоцид, равномерно наносят 1 мл спер грибов, Содержащий 1,00t tO,01 млн. спор, выдерживают при 29 Ј2СС и относительной влажности 90% и через каждые сень суток проводят отборы с определением выросшей биомассы.

Рассчитывают кинетические параметры биоцнна по формулам

-- S iiiuK.t., i + R( ехр -Ь,

J3.i

In

ы

Кс

(Јi - Ьо.)

b;d

be - b,

te raCiMafeu 35

m.

in

40

L

o;

Я; максимальное значение удельной биомассы, достигнутое при развитии грибов в присутствии биоцида каждой из концентраций и в контрольной пробе, мг/см5 или мг/дмэ;

среднее арифметическое значение удельной биомассы для каждой из концентраций и в контрольной пробе при каждом из отборов, мг/см2 дз или мг/дм ; минимальное экспериментально полученное значение лаг-фазы для данной, концентрации биоцида и в -контрольной пробе, ч; продолжительность выдержки, после которой произведен отбор, ч; кинетический параметр, характеризующий способность споры образовывать биомасёу при

50

55

0

5

0

5

0

5

0

з

0

5

данной концентрации биоцида и в контрольной пробе; Ц - кинетический параметр,

характеризующий удельную скорость развития микроорганизмов на данной питательной среде (при i-той концентрации биоцида), ч ;

К-, - константа, хярактери- зующая зависимость лаг-фазы от концентрации данного биоцида; К с - константа, характеризующая зависимоегь удельной скорости роста грибов от концентрации и численно равная концентрации бно- цнда, при которой параметр b уменьшается в два раза по сравнению с развитием грибов на среде, не содержащей биоцида; концентрация биоцида, включая С , 0, от нулевого значения до С make;

минимальное значение лаг-фазы при каждой концентрации биоцида, ч;

минимальное значение лаг-фазы в контрольной пробе, ч; кинетический параметр, характеризующий удельную скорость развития грибов на данной питательной среде в отсутствие биоцида. Псвторность в опыте по испытанию антигрибного действия биоцина 30- кратная (30 образцов) (табл.1).

i

Результаты оценки биоцидной активности испытуемого соединения представлены в табл.1. При использовании данного способа ошибка при определе-, нии биомассы мнкромицетов, развивающихся на гидрогелевой подложке, 10 - 15%, Установлена величина лаг-фазы в развитии микроорганизмов в зависимости ov концентрации биоцина в подложке и константы Кс и К, характеС -

Li Т,„ bn

ричуюгдие биоцидную активность биоцина.

Пример 2. Осаждение био- дана на поверхность агаризованной питательной среды проводят по следу™ ющей методике.

Готовят раствор биоцина в хлороформе молярной концентрацией 1 х к КГ моль/дм3. Затем s сосуд типа чашки Йетри с внутренним диаметром 100 мм, выполненный из фторопласта- заливают 5 см3 приготовленного рствора и ставят его на полку термостата, установленную строго горизон- тально по уровню, В термостате устанавливают температуру 55°С и проводят испарение растворителя до постоянного веса сосуда г, осажденным на дне биоцином. После этого подго- тавливают агаризованную среду Чапека Докса, для чего 0S7 г калия фосфорнокислого однозамещенного5 0,3 г калия фосфорнокислого двухзамещенного 3-водного, 0,5 г магния сернокисло- го 7-водного, 2,0 г калия хлористого,, 0,01 г железа сернокислого за- кисного 7-водного растворяют в кол- бе в 500 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и добавляют , дистиллированную воду до 1000 затем в раствор добавляют 20 г микробиологического агара и нагревают на водяной бане до полного расплавления агара. При нагревании колбу со средой взбалтывают, В полученную однородную массу добавляют 30 г сахарозы, после чего содержимое колбы тщательно перемешивают.

В стерилизованную фторопластовую чашку Петри с осажденнным на дно равномерным слоем биоцина заливают 5 см3 расплавленной агаризованной среды Чапека-Докса, После этого чашки Петри накрывают крышками и сте- рилизуют при давлении 0,1 МПа и температуре в течение 15-20 мин, после чего охлаждают в стерильных условиях и вынимают из чашки Петри застывшую агаризованную подложку, на нижней поверхности которой находится приставший к ней равномерный слой биоцина. Помещают эти подложки в стеклянные чагаки Петри, причем слой биоцина должен быть обращен кверху. В дальнейшем агаризованные подложки с осажденными на них различными концентрациями биоцина в моль/смг используют длч определения

0 5 0 .

Q 5 д

5

его биоцидной эффективности по лаг- фазе и кинетическим параметрам развития грибов, указанных в примере 1 (табл.2).

Эти исследования и, расчет кинетических параметров эффективности биоцидов проводят как в примере 1. Пов- торность в опыте 30-кратная (30 образцов) .

При нанесении биоцида на агаровую питательную среду Чапека-Докса ошибка в определении биомассы микро- мицетов составляет в среднем 15/S. Установлен период лаг-фазы в развитии грибов в зависимости от концентрации биоцина на поверхности среды (табл.2) и рассчитаны величины констант К с и К, характеризующие биоцидную эффективность веществ.

Пример 3. Оценка способа нанесения на гидрогелевую подложку и агаровые по сравнению с известным способом.

Описанным в примерах 1 и 2 способом осаждают на гидрогелевую подложку и среду Чапека-Докса биоциды: био- цин, 2-индонен, амарин (7,5 дигндро- -2,4,5 трифенилимидазол), 3-цикло- -гексил-этоксииминолино-4-хлор-2,5- -диокси-3-пиралин (табл.3) и рассчитывают биоцидную активность 2-индоне- на и биоцина (табл.4).

Согласно известному способу водо- нерастворимые биоциды также осаждают из раствора в органических растворителях путем испарения жидкой фазы. Затем осажденный биоцид накрывают гидрогелевой подложкой. Биоцид прилипает к подложке, и его поверхностную концентрацию рассчитывают исходя из количества биоцида в растворе.

Экспериментальное осуществление известного способа показывает, что не весь осажденный биоцид прилипает к поверхности и намного (в 10 раз) менее равномерно распределяется по поверхности подложки и агаровой питательной среды. Равномерность рас- i пределения, например, биоцина по поверхности подложки или среды состава ляет 1.1GT6 i 2,4. и ,4 х х , а при нанесении известным способом - + 7, и ± 9 И0 .

Результаты оценки биоцидной активности веществ при их нанесении

на гидрогелевую подложку и агариэо- ванную среду способом, описанным в

и известным приведе

примерах 1 и 2, ныв табл.4..

Данш.|е табл.А свидетельствуют, что ошибка в определении биомассы при нанесении биоцидов-бноцина и 2- -индонена - известным способом составляет 25-35%..

В связи с этим полученные значе- ния константы Ке для испытываемых биоцидов практически между собой не различаются, в то время как биоцин значительно эффективнее 2-индонена. При использовании описанного в примерах 1 и 2 способа нанесения водоне- растворимых биоцидов на поверхность подложки и среды ошибка, при определении биомассы микроорганизмов сокраца ется до 1t)-15%, в связи с чем повышается точность определения хконстан- ты К, и поэтому можно объективно определить сравнительную активность биоцидов и их эффективность.

Данные табл.4 показывают также, .что при использовании предложенного способа удается более точно определить продолжительность периода адаптации микроорганизмов при различных концентрациях биоцидов (лас-фазы). Так, например, для биоцина период адаптации (лаг-фаза) для более чем 80% образцов одинаков, а согласно известному способу значения лаг-фазы

имеют большой раз б, рос, что вносит большую ошибку при определении констант Ки и Кс, которая достигает 35 - 40%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что способ позволяет со значительно большей точностью определять лаг-фазу и кинетн- - ческие константы К ц и Кс развития микроорганизмов в зависимости от применяемого биоцида, что дает возможность оценить их эффективность.

20 5

15 Формула изобретения

1.Способ нанесения водонераство- римого биоцида на поверхность гидро- гелевой подложки, предусматривающий приготовление раствора биоцида в органической растворителе, осаждение биоцида на дно,сосуда путем испарения растворителя, приготовление гелеоб- разукяцей подложки и контактирование биоцида с подложкой, отличающийся тем, что, с целью более полного нанесения биоцида на подложку, приготовление и контактирование гелеобразующей подложки осуществляют в том же сосуде непосредственно на осажденном биоциде.

2.Способ по п.1, отличающийся тем, что при нанесении , биоцида на поверхность эглровой Питательной среды для осаждения биоцида используют сосуд из Фторопласта,

Оценка эффективности способа нанесения биоцина на поверхность гелеобразующей подложки

Изобретение относится к испыта- ниям материалов на устойчивость к воздействию микроорганизмов и может ,быть применено при определений эффективности биоцидов. Целью изобретения является наиболее полное .нанесение биоцида на подложку.Готовят раствор водонерастворимого биоцида в органическом растворителе. Осаждение биоцида проводят на дно горизонтально (по уровню) установленного сосуда путем испарения растворителя. Затем непосредственно в сосуде с осажденным биоцидом синтезируют гелеобраэ- ную подложку или заливают расплавленную агаровую среду. Для нанесения биоцида на агаровую питательную среду сосуд должен быть выполнен из фторопласта, в случае с гидрогеле- вой подложкой он ,. может быть выполнен из стекла. Способ позволяет добиться более полного нанесения биоцида на поверхность подложки и ере2- ды и до 10 раз повысить равномерность нанесения биоцида, это позволяет точнее оценить эффективность различных биоцидов. 1 ч.п. ф-лы, 4 табл. W е±

MO- i.io-4i,5.io-e |f f- Sf.

4-1СГ6

,3 tCTe p 0,6±0,05 1,S+0,14 2,5±0,2 0,4liO,04 3,OiO,3

1,2+0,11 2,8±0,3 3, 0,41±0,04 40J0t3

Сравнительная оценка способа равномерного нанесения биоцидов на поверхность гелеобразующей подложки и агаровой питательной среды

гидро-2, 4,5-трифенилимидазол) 310 3-циклогексил-это- ксииминолино-4-хлор- -2,5 диокси-3 пи- раллин2110 6

Таблица 3

±5,1-10 3-10 ±2,

340 t4,2MO

3-10 Ј2,

2-1(Г ±1,8-10

гв

2 -10 ±7,1-

2-1( 1,3-10

2 -10 ±4,3-10

-7

Оценка эффективности действия на микроскопические грибы биоцидов при различных способах нанесения иг на поверхности гелеоСраэуюшеЛ подпошги н агаровой среды.

На гидрогелевой подложке

Ut

1,1240,11 2,.3 3.6i0,25 f2; 0,6±0,05 1s5±0.t4 2,5tO,2

0,,04 4,,3

3,OtO,52 3,9ifl,6 J,,42 2.9±0,71

2,7tO,4f 3,6tO,25 1,3tO,17 2,8±0,зГ

0,4.t±0,17 3,,7

0,4l±0,03 4,,3

Чя wi

OJ

«

,8iO,4 t,5tO,8 2,7tt,t 1,610,3 1,340,3 3,2+0,6

0,35tO,t2 3,110,8

1,440,11 2,,32 4,010,-t7

0,2910,03 5,440.2 1,140,10 2.0iO,tS 3,240,28 ,

1,,34 2,6tO,57 3,,81 0,8±0,18 2,140.45 3,240,89

0,3940.21 4,210,8

(лаг-фаза), Н - (энанвнатель) количество образцов, дпя Которых наблюдались дшпш значения L, Т - тачание, выбранное для расчета KL. Всего испытывая по 30 овр&эдов.

11л nj-4pHjoe«Hnoft питательной сред