Способ культивирования микромицета Trichoderma virens Российский патент 2019 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий.

Микромицет Trichoderma virens - один из наиболее активных продуцентов биопрепаратов, применяемых в защите сельскохозяйственных растений от фитопатогенов.

Запатентованные известные способы выращивания грибов в различных биотехнологических системах касаются только различий в приготовлении питательной среды, на которой будут культивироваться грибы, с оптимизированными по питательным свойствам субстратами.

Например, запатентован способ получения среды [RU 2125364], который заключается в следующем: готовят реакционную смесь, состоящую из водного раствора поливинилового спирта (ПВС), водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) и сшивающего агента (мочевина, глиоксаль). Смесь вспенивают до увеличения объема в 2,5-3 раза и вводят катализатор реакции ацеталирования. Затем в вспененную массу вводят целлюлозные отходы текстильного производства и полученную композицию заливают в формы, кондиционируют при нагревании, промывают до нейтрального значения рН и отсутствия следов сшивающего агента в промывных водах. Промытую композицию пропитывают питательным раствором. В качестве отходов текстильного производства используют льняную костру и/или хлопковые очесы "галочка". Питательный раствор содержит глюкозу, пептон, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄, CuSO₄, FeSO₄, H₂O, CaCl₂.

Среда позволяет увеличить урожайность грибов.

Недостатки способа - сложность воспроизведения в лабораторных условиях, необходимость в целлюлозных отходах и их обработке.

Известен способ приготовления плотной питательной среды, описанный в патенте RU 2396335 и предусматривающий внесение в жидкий питательный субстрат уплотнителя, добавление ингредиентов согласно стандартной прописи среды и стерилизацию в автоклаве. В охлажденную до температуры 65°С расплавленную среду вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтордекалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм. Это приводит к количественному увеличению прорастания засеваемой популяции микроорганизмов, увеличению интенсивности роста и увеличению урожая растущей микробной культуры.

Недостаток подобного метода заключается в дополнительных затратах при приготовлении эмульсии перфторорганических соединений.

Известен способ культивирования микромицета Trichoderma virens 3Х [Т. Щербакова, И. Попушной. Влияние температуры на рост гриба - антагониста Trichoderma virens. Институт защиты растений и экологического земледелия. Stiinta adricola, nr. 1/2010. ISSN 1857-0003], где гриб культивировали на плотной картофельно-сахарозной питательной среде в чашках Петри. Посев производили агаровым блоком диаметром 6 мм в центре чашки (Н. Егоров, 1995). Повторность опыта четырехкратная. Поскольку основным показателем развития гриба являлась скорость роста, ежедневно измеряли диаметр выросших колоний (в мм) при температурном оптимуме для роста гриба T. virens 3Х 25-30°С (прототип).

Однако указанный способ не дает необходимую скорость роста для массового культивирования.

Задачей заявляемого способа является управление процессом роста и развития колонии микромицета.

Технический результат заключается в стимуляции роста и развития колонии микромицета.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе культивирования микромицета Trichoderma virens подготавливают стерильную чашку Петри необходимого диаметра из пластика или стекла, в которую заливается плотная питательная среда, на которую равномерно вносится порошок из минерала шунгита, куда затем высевается микромицет любым удобным методом (агаровым блоком или суспензией спор).

Сверху и снизу от чашки устанавливают магниты с разными полюсами.

Между магнитами возможна установка нескольких рядов подготовленных и засеянных чашек.

На фиг. 1 изображена установка для культивирования микромицета Trichoderma virens, где:

1. Магниты;

2. Чашка Петри;

3. Колония микромицета Trichoderma virens;

4. Плотная питательная среда;

5. Порошок шунгита.

Сущность изобретения заключается во внесении шунгита в среду культивирования микромицета под воздействием постоянного магнитного поля (ПМП) для увеличения скорости роста.

Преимущество, при желании увеличить скорость роста колоний, имеют те способы, которые не требуют большого количества манипуляций при подготовке сред.

Метод, использующий постоянное магнитное поле и шунгит более выгоден экономически, за счет дешевизны установки и шунгита, а так же прост и удобен в применении.

Для осуществление способа использовали микромицет Trichoderma virens штамм BKM F-1117. Экспериментальная установка представляла собой магниты 1 с прикрепленными на них стальными пластинами в форме дисков диаметром 9 см с магнитной индукцией поля 30 мТл. Установку располагали на деревянной подложке на металлическом стеллаже. Гриб культивировали в чашке Петри 2 на плотной питательной среде 4 Чапека-Докса в течение 6 дней. Состав плотной питательной среды (ППС) 4 Чапека - Докса (г/л): NaNO₃ - 2,0; KCl - 0,5; MgSO₄ ⋅ 7H₂O - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; K₂HPO₄ - 0,3; FeSO₄ ⋅ 7H₂O - 0,01; микробиологический агар - 20,0; сахароза - 30,0. Режим стерилизации среды: без сахарозы - 1 атм, 60 минут, после добавления сахарозы - 0,5 атм, 30 минут. Остывшую до 50-60°С среду разливали в стерильном боксе в одноразовые пластиковые чашки Петри 4 (D = 5 см) толщиной 3 мм. После застывания в чашки равномерно по поверхности среды с кальки вносили 0,1 г шунгитового порошка 5 марки "Петрошунгит". В центр каждой чашки Петри на питательную среду помещали агаровый блок диаметром 2 мм из краевой зоны колонии микромицета Trichoderma virens 3, которую предварительно выращивали в течение 6 дней на плотной питательной среде 4 Чапека-Докса. Чашки Петри 2 оборачивали плотным черным полиэтиленом во избежание попадания на них света и помещали между магнитами 1 установки. Выращивали при комнатной температуре.

Изучали влияние шунгита на скорость роста микромицета Trichoderma virens под воздействием постоянного магнитного поля на первые сутки и в течение трех суток. Результаты оценивали посредством анализа ростовых характеристик (диаметр) колоний.

Скорость роста колонии отслеживалась в течение 3-х суток для каждого варианта посева (фиг. 2), где изображены графики зависимости диаметра колонии микромицета Trichoderma virens от времени культивирования. Эти графики были построены при разных условиях проведения эксперимента, а именно:

синим пунктиром изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 только на плотной питательной среде 4 (контроль);

сиреневой сплошной линией изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, но помещенной в постоянное магнитное поле (ПМП), создаваемое магнитными полюсами 1;

фиолетовой сплошной линией изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, выполненной с внесенным на ее поверхность порошком из минерала шунгита 5;

голубой сплошной линией изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, выполненной с внесенным на ее поверхность порошком из графита;

оранжевой сплошной линией изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, выполненной с внесенным на ее поверхность порошком из активированного угля;

зеленой сплошной линией изображен график, построенный при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, выполненной с внесенным на ее поверхность порошком из минерала шунгита 5, помещенной в постоянное магнитное поле (ПМП), создаваемое магнитными полюсами 2.

Из графиков видно, что самый медленный рост наблюдался при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 только на плотной питательной среде 4 (контроль), в то время, как самый интенсивный рост наблюдался при культивировании микромицета Trichoderma virens 3 на плотной питательной среде 4, выполненной с внесенным на ее поверхность порошком из минерала шунгита 5, помещенной в постоянное магнитное поле (ПМП), создаваемое магнитными полюсами 2.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования микромицета Trichoderma virens включает подготовку плотной питательной среды, на поверхность которой вносят порошок из минерала шунгита и посев на нее микромицета Trichoderma virens с последующим культивированием под воздействием постоянного магнитного поля при комнатной температуре. Изобретение позволяет повысить интенсивность роста и развития колонии микромицета. 2 ил.

Способ культивирования микромицета Trichoderma virens путем посева микромицета Trichoderma virens на плотную питательную среду, отличающийся тем, что плотную питательную среду выполняют с внесением на ее поверхность порошка из минерала шунгита, а культивирование осуществляют под воздействием постоянного магнитного поля.