Штамм РнаGUм реSтIS для внутривидовой дифференциации возбудителя чумы Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике чумы.

Цель изобретения - чумной фаг Ф-132 нового III серологического типа, используемый для внутривидовой дифференциации микроба чумы.

Фаг Ф-132 получен в 1983 г. из штамма 2247 чумного микроба, выделенного от блох в приаральских Кара-Ку- мах Среднеазиатского пустынного очага, и может быть использован как представитель чумных фагов нового III серологического типа и как диагностический для внутривидовой дифференциации возбудителя чумы.

Фаг Ф-132 депонирован и хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИ вакцин и сывороток под номером Ф-132.

Чумной фаг Ф-132 имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристику.

Величина негативных колоний на газоне чумного вакционного штамма ЕВ-76, выращенном двухслойным методом на агаре Хоттингера рН 7,1 равная около 1 мм в диаметре, округлой формы, с четким, хорошо контуриро- ванным краем, с прозрачным центром и слабо выраженной полупрозрачной периферией.

Фаг Ф-132 имеет головку правильной гексагональной формы и отросток, способный к сокращению. Больший разО

мер головкиосоставляет А меньший 598i26 А. Длина отростка 1203± А его ширина 225±10 А. Длина сократившегося чехла 554Ц7 А, его ширина 278+14 A.

сд

sj

00

;о

4

По классификации Л.С.Тихоненко (1968) фаг относится к пятой морфологической группе.

Одиночный цикл развития фага Ф-13 на клетках чумного вакционного штамма ЕВ-76 при 28°С в бульоне ЛБ составляет 150 мин. Период нарастания концентрации фаговых корпускул продолжается 30 мин. Урожай на одну кле ку бактерий находится в пределах 9 - 74 корпускул. Константы адсорбции

,

о

составляли: К5 3,710 , К,02,2-10 К,5 1,9- 1СГ1

Оптимальная множественность заражения составляет 10 - 10.

Фаг активно репродуцируется на клетках чумного вакционного штамма ЕВ-76 в жидких питательных средах рН 7,1-7,2 при 28°С. Заражение 16-18-часовой бульонной культуры этого штамма, имеющей концентрацию клеток n x

а

х 10 фагом с указанной множественностью позволяет получать через 18 - 20 ч лизаты с титром п«107 -п-108 БОЕ/мл

Полезные свойства фагов иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Антифаговую сыворотку получают иммунизацией кроликов фагом Ф-132 по методу Ю.Н.Марьиной (1981).

Сыворотка специфически активна пртив гомологичного фага и не вызывает инактивации чумных фагов I и II серо типов. В свою очередь сыворотки против чумных фагов I и II серотипов, нейтрализуя гомологичные фаги, не обладают активностью в отношении фаг Ф-132 (табл. 1).

Специфичность и диапазон литичес- кой активности фага Ф-132 испытывают на 1540 штаммах. Чумной фаг Ф-132 III серотипа обладает выраженной специфичностью. Фаг лизирует 421 штамм возбудителя чумы при этом проявляет активность лишь в отношении I штамма псевдотуберкулезного микроба и I штамма возбудителя кишечного иерсиниоза (табл. 2) .

При явно выраженной видовой лити- ческой специфичности фаг Ф-132 обладает не одинаковой активностью в отношении штаммов, выделенных в различных природных очагах чумы.

Q

0

0

5

5

0

5

0

Из 61 штамма, выделенного в Лени- наканском и Зангезуро-Карабахском очагах Закавказского Нагорья, 56 (91,8%) составляют резистентные. Из

19штаммов, изолированных в Монголии, устойчивыми являются 10 (52,6%), а

4 штамма из Тувы представляют только устойчивые формы. Штаммы из других природных очагов подвергаются лизису почти полностью (табл. 3).

Существование устойчивых к фагу Ф-132 форм чумного микроба преимущественно в отдельных природных очагах этой индфекции создает своеобразную маркировку возбудителя.

Пример 2. Препарат фага Ф-132 используют для внутривидовой дифференциации возбудителя чумы следующим образом.

В пробирку с 3,0-4,5 мл 0,7% агара (на любой питательной основе), расплавленного и остуженного до 45-47°С, добавляют 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры (или 1 миллиардную взвесь 18-часовой агаровой) исследуемого штамма чумного микроба и выливают на 1,5%-ную агаровую пластинку в чашку Петри. После застывания мягкого слоя чашку немного подсушивают и на поверхность агара наносят каплю фага Ф-132 с концентрацией БОЕ/мл. Посевы инкубируют в термостате при 28 . Результаты учитывают через 1820ч, рассматривая чашки в проходящем свете.

I

Отсутствие лизиса на месте нанесения фага означает, что исследуемый штамм бактерий чумы принадлежит к, возбудителю, циркулирующему в Лени- наканском и Зангезуро-Карабахском очагах Закавказского Нагорья, Монголии и Туве. Наличие лизиса на месте нанесения фага свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к возбудителю чумы, выделенному в других природных очагах этой инфекции.

Формула изо б.р е т е н и я

Штамм Phagum pestis ТНИИВС Ф-132 для внутривидовой дифференциации возбудителя чумы.

Таблица 1

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике чумы. Целью изобретения является чумной фаг Ф-132 нового III серологического типа для внутривидовой дифференциации микроба чумы. Фаг Ф-132 обладает хорошо выраженной видовой литической специфичностью, что позволяет использовать его для дифференциации штаммов возбудителя чумы, выделенных в различных очагах. 3 табл.

Нейтрализующее действие кроличьих антифаговых сывороток на фаги чумного микроба

Сыворотки против Нейтрализующее действие фагов фагов (разведения)

Ф-132 Покровский I Л-413 С III серотип I серотип I II серотип

Ф-132 (1:80) 98,8% О О Покровский (1:200) 0 99,0% О Л-413 С (1:100) ОО 100%

- использовали коммерческую антифаговую сыворотку

Таблица 2

Специфичность и диапазон действия чумного фага Ф-132 нового III серологического типа

Вид бактерий Количество Из них

исследован- 1

ных штаммов лизируются I не лизиру- | ются

J. pebtis51242191

J. pseudotuberculosis2621261

J. enterocolitica2521251

E. coli1580158

Shigella90090 Представители других

видов 2660266

Т в в л ч « а 3

Лнтическая активность чумного фага Ф-132 нового III серологического типа в отношении штаммов микроба чумы, выделенных в различных природных очагах

Место выделения штамма КоличествоИз них

исследован-

ных штаммов лнзируются не лнэнруются

абсол. I 2

Закавказское нагорье: Зннгезуро-Карабахский

очаг56551 91,8

Ленинаханский очаг505 100

Монголия19910 52,6

Тува404 100

Другие природные очаги, мутанты, штаммы неизвестного происхождения 42840721 4,9

ВСЕГО:5124219117,8

Составитель О,Жакетов Редактор М.Недолуженко Техред М.Дидык Корректор Л.Бескид

Заказ 1892Тираж 480 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101