Штамм @ @ @ -1,используемый для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы Советский патент 1986 года по МПК C12N7/00 

X)

DO 4i

V

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике чумы для целей внутривидовой дифференциации иерсиний чумы, а также в генетических и микробиологических экспериментах..

Известны псевдотуберкулезный и ч-|)Гмный диагностические бактериофаги Д.Г1Я дифференциации подвидов чумного М1дкробао

Однако известные бактериофап лизируют 98-99%- штаммов псевдотуберкулезного микроба и 57% музейный культур возбудителя чумы, что приводит к диагностическим ошибкам.

Целью изобретения является получение бактериофага с узким спектром литической активности в отношении отдельных групп штаммов возбудителя чумы и повьшение качества дифференциации бактерий из различных природных очагов чумы.

Поставленная цель достигается использованием штамма Phagum pestis М-1.

Для получения фага были изучены на наличие фагов, активных в отношении бактерий чумы, 150 свежевьщеленных и музейных штаммов E.coli.

Один из изученных фильтратов (К235) образовывал на штамме .J.pestis 400(290) (Закавказское высокогорье) единичные мелкие неправильной формы относительно прозрачные негативные колонии.

С целью вьщеления однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фага М-1 бьта получена путем 10-кратного пассирования отдельных негативных колоний на штамму,I.Pestis 400(290).

Бактериофаг М-1 депонирован в лаборатории.холерных фагов с музеем института 1икроб за № 101 .

Штамм М-1 чумного умеренного фага имеет следуюш 1е морфологические и физиологические характеристики.

Частица фага М-1 имеет головку гексагонапьной формы размером 51,4 ±2,3 им, отросток длиною 1 4,4tl ,6 нм, шириной 14,2tO,4 нм и сокращающийся чехол (длина в состоянии сокращения 50±1,8 и ширина 2011,7 нм, что дает основание отнести этот фаг к Т морфологической группе).

Бактериофаг М-1 образует относительно прозрачные колонии диаметром

342

0,5-1 мм, отличающиеся от крупных (4-8 мм) негативных колоний известного псевдотуберкулезного фага.

Одиночный цикл развития на щтам ме I.Pestis 400(290) характеризуется следующими показателями: константа скорости адсорбции 2,410 мл/мин, латентный период 90-100 мин, средний урожай 8,4 фаговых частиц на 1 бактериальную клетку.

В табл. приведена серологическая характеристика фага М-1.

По серологическим свойствам бактериофаг М-1 относится к II серотипу чумных фагов (табл.1).

Диапазон и специфичность действия фага М-1 изучены на 985 штаммах возбудителя чумы, 184 культурах псевдотуберкулезного микроба и 57 щтаммах возбудителя кишечного иерсиниоза. Испытания проведены в сравнении с псевдотуберкулезным диагностическим фагом (табл.2).

В табл. 2.приведена литическая активность чумных бактериофагов М-1, Л-143 с и псевдотуберкулезного диагностического в отношении штаммов бактерий рода lersinia.

Пример. Фаг М-1 репродуцируется на клетках штамма Т.Pestis 400(290) в бульоне Хоттингера, рН7,2

При посевной дозе 2-3-10 клеток на 1 мл среды и множественности инфекции 0,1-0,4 при инкубации с постоянным шюттелированием в течение 16-18 ч при 28 С накапливается до п«10 фаговых частиц на 1 мл.

Для получения препарата фага М-1 18-часовую бульонную культуру штамма I.Pestis 400(290) вносят в свежий бульон Хоттингера из расчета конечной концентрации клеток на 1 мл; после 6 ч подращивания при 28 С

с постоянным шюттелированием и дос9

тижением культурой плотности 2-310 клеток на 1 мл добавляют фаг М-1 из расчета множественности инфекции 0,10,4. Через 16-18 ч шюттелирования

при 28 С к фаголизату добавляют хлороформ до 2% по объему. Фаголизат с добавленным хлороформом выдерживают 1,5-2 ч при комнатной температуре (20-24.С) и 10-12 ч в холодильнике

(4-6 С).Затем фаголизат фильтруют через бактериальные фильтры марки Ф-3, Ф-5. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специфическую и общую стерильность и активность.

Фаг М-1, подобно типовым фагам других видов, используют /щя фаготипирования штаммов возбудителя чумы в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ), ДРТ фага определяется следующим.образом: 18-часовую бульонную индикйторную культуру I.Pestis 400(290) в рбъеме 0,3 мл .вносят в пробирку с 4,5 мл расплавленного и остуженного до 0,7%-ного агара Хоттингера(,2), перемешивают и содержимое пробирки выливают на поверхность агаровой пластинки (1,2%-ный агар Хоттингера, рН 7,2).После застывания, второго слоя на его поверхность петлей или штампом наносят десятикратные

разведения фага М-1. После подсыхания капель посевы инкубируют при 28 С в течение 18-20 4i За дифференцирующий рабочий титр принимают то разведение, в котором фаг М-1 образует на месте нанесения не менее 10 негативных колоний.

Изучение чувствительности исследуемых культур к фагу М-1 проводится так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.

Использование фага М-1 в практике лабораторного исследования позволит повысить эффективность эпизоотологических, микробиологических, генетических исследований, направленных на борьбу с возбудителями чумы-.

Таблица 1

Штамм Phagum pestis M-l 101. (коллекция фагов Всесоюзного научноисследовательского противочумного института Микроб), используемый для внутривидовой дифференциации иер- синий чумы. § (Л

Антифаговая I. серотипа Антифаговая II серотипа Антифаговая М-1Примечание. Числитель - % нейтрализованных фаговых корпускул; знаменатель - константа нейтрализации.

Возбуди- Закавказский

тель равнИнночумы предгорный 97

Закавказский

высокогорный 242 78,4 99,5

0/98/300

98/83,72

99,6/441,6 97,2/283,4

Таблица 2

98,9

100

100

Прикаспийский

101 степной

Продолжение табл. 2

100

100