ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS SUBSP.PESTIS КМ 1190 (И-3244), СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДУ pYX 16, ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/00 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к лабораторной диагностике чумы, и может быть использовано для внутривидовой дифференциации чумного микроба из различных природных очагов этой инфекции, при расследовании вспышек и спорадических случаев заболевания чумой, а также для дальнейшего изучения внехромосомных элементов наследственности возбудителя чумы.

Известные референтные штаммы чумного микроба, например, штамм ЕВ и эталонные для большинства природных очагов, содержат в геноме три резидентные плазмиды молекулярной массой 6, 45-47, 61 МД. Для абсолютного большинства изолятов Y. pestis дикого типа также характерен этот набор плазмид.

Цель изобретения - выявление у штамма Yersinia pestis subsp. pestis КМ 1190 (И-3244) плазмиды pYX 16, используемой для внутривидовой дифференциации чумного микроба.

Сущностью изобретения является обнаружение плазмиды pYX 16 в геноме штамма Y. pestis КМ 1190 (И-3244).

Штамм КМ 1190 (И-3244) выделен из даурской пищухи на территории природного очага чумы Хух-Сэрх-Мунх-Хайрхан в Северо-Западной Монголии в 1988 г., является типичным, в том числе и по плазмидному составу для данного природного очага. Депонирован в Государственной коллекции бактериальных возбудителей I-II групп патогенности при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" под N КМ 1190 (И-3244). Характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Мелкие короткие кокковидные палочки 0,5-0,8 х 1,5-2 мкм. Спор не образуют, неподвижные, при выращивании на кровяном агаре при температуре 37^oC образуют капсулу, грамотрицательные. Штамм в R-форме. На пластинках агара Хоттингера (pH 7,2) через 20 - 24 ч под малым увеличением микроскопа колонии светлые, плоские, с изрезанными краями - "кружевные платочки", через 48 ч колонии диаметром 2 - 2,5 мм серовато-белые, под микроскопом с выпуклым бугристым хромогенным центром и светлой с изрезанными (волнистыми) краями периферией. В бульоне Хоттингера (pH 7,2) наблюдается рост в виде хлопьевидного осадка на дне, хлопьев на стенках пробирки и нежной пленки на поверхности среды, бульон остается прозрачным.

Физиолого-биологические признаки. Штамм КМ 1190 (И-3244) растет на питательных средах, приготовленных из гидролизатов Хоттингера (мяса, казеина, дрожжей). Оптимальное значение pH 7,0 - 7,2. Оптимальная температура выращивания микроба - 28^oC. Факультативный анаэроб.

Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, галактозу, арабинозу, глицерин, маннозу, эскулин, трегалозу, не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу, сорбит, раффинозу, мелибиозу. Восстанавливает нитраты в нитриты, выделяет сероводород, не образует индола, не расщепляет желатину, не обладает уреазной активностью, не свертывает молоко.

Штамм КМ 1190 (И-3244) лизируется чумными (Покровской и Л-413 "С") и псевдотуберкулезным бактериофагами, стрептомицинчувствительный. Обладает фибринолитической и плазмокоагулазной активностью, синтезирует пестицин 1 и не чувствителен к нему. Растет на синтетическом агаре Берроуза и Бэкона в присутствии метабисульфита натрия, глюкозы и трех аминокислот: фенилаланина, метионина и цистеина. Проявляет гемолитическую активность в жидких средах. Продуцирует фракцию 1, "мышиный" токсин.

Вирулентность для лабораторных животных: штамм КМ 1190 (И-3244) вирулентен для белых мышей (ЛЛ₅₀ 32 м.к.) и морских свинок (ЛД₅₀ 10 м.к.); зависит от ионов Ca²⁺ при 37^oC и растет в виде пигментсорбирующих колоний на среде с гемином.

Генетические особенности: штамм КМ 1190 (И-3244) кроме трех обычных резидентных плазмид чумного микроба (6, 47 и 61 МД) содержит четвертую плазмиду с молекулярной массой 16 МД, обозначенную pYX 16. На момент оформления заявки этот внехромосомный репликон является криптическим. Возможное функциональное значение по предварительным данным - детерминирование синтеза капсульного антигена - фракция 1. Плазмида многокопийная, проявляется на электрофореграмме в виде широкой полосы.

Пример 1. В 1989 г. впервые на территории природного очага чумы Хух-Сэрх-Мунх-Хайрхан, входящего в группу очагов Монгольского Алтая, отмечен случай заражения человека чумой, закончившийся летальным исходом. При проведении эпидемиологического расследования встал вопрос об исключении заносного (из другого очага) варианта заражения. При сравнительном плазмидном анализе было установлено, что все изоляты из данного природного очага как и штамм, изолированный из секционного материала от погибшего больного А., содержали идентичную по электрофоретической подвижности криптическую плазмиду молекулярной массой 16 МД, условно названную pYX 16. Штаммы возбудителя чумы из других очагов Монгольского и Российского Алтая плазмиду с подобной электрофоретической подвижностью не содержали. Этот факт позволил исключить заносной характер заражения человека чумой.

Пример 2. Использование сравнительного электрофоретического анализа лизата штамма Y. pestis КМ 1190 (И-3244) с плазмидой pYX 16 и лизатов других географически близких изолятов чумного микроба позволило подтвердить, что северо-восточная граница природного рычага Хух-Сэрх-Мунх-Хайрхан проходит по реке Хобд и озеру Толбонуур, так как у штаммов возбудителя чумы, выделенных по левобережью р. Хобд и к северо-востоку от озера Толбонуур на электрофореграммах плазмида pYX 16 не обнаруживается.

Штамм бактерий Yersinia pestis subsp.pestis выделен из даурской пищухи на территории природного очага чумы в Северной Монголии. Обладает культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, типичными для возбудителя чумы. Уникальная особенность штамма заключается в том, что помимо трех обычных резидентных плазмид чумного микроба он содержит четвертую плазмиду pYX 16 с мол.м. 16 МД. Наличие данной плазмиды позволяет использовать штамм для внутривидовой дифференциации чумного микроба.

\ \\1 Штамм бактерий Yersinia pestis subsp.pestis КМ 1190(И-3244), содержащий плазмиду pYX 16, для внутривидовой дифференциации чумного микроба.