СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА ПО N-АЦЕТИЛ-БЕТА-D-ГЛЮКОЗАМИНИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 G01N21/64 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при экспресс-диагностике для всех видов штаммов, принадлежащих к видам Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis, их дифференциации друг от друга.

В настоящее время в лабораторной диагностике существует проблема при дифференциации двух близкородственных и высокогомологичных (степень гомологии на уровне ДНК составляет более 90%) видов Yersinia чумного и псевдотуберкулезного микробов. Это обстоятельство существенно при мониторинге природных очагов чумы, реально действующих на территории стран СНГ.

Штаммы псевдотуберкулезного микроба имеют широкое географическое распространение, они патогенны для большого круга теплокровных животных и часто выделяются от грызунов, обитающих на территориях природных очагов чумы. И хотя эти микроорганизмы вызывают разные по клинике и тяжести заболевания, многие фенотипические свойства у них близки с микробом чумы, что затрудняет их дифференциацию.

Известно, что в деградации широко распространенного в природе хитина, который является полимером N-ацетил-β-D-глюкозамина, соединенного β-1,4-гликозидной связью, принимают участие несколько хитиназ, включая экзохитиназу (N ацетил - β-D-глюкозаминидазу, которая отщепляет от хитинсодержащих субстратов легко утилизируемые микробной клеткой крайние остатки N-ацетилглюкозамина (см. 1,2).

Известно о повреждении у возбудителя чумы в результате делеции гена chiC (хитиназы, эндо-β-N-ацетилглюкозаминидазы), а также β-гексозаминидазы (nghA, YPO2632) в результате сдвига рамки считывания, что выражается в способности микроба блокировать/колонизировать преджелудок блохи благодаря образованию аггрегатов из возбудителя и внеклеточного матрикса, тем самым обеспечивая его передачу чувствительному хозяину в результате укуса и последующего срыгивания излишками крови (см.3).

Псевдотуберкулезный микроб, обладающий активностью ферментов экзохитиназы (YTB3365) и β-гексозаминидазы (YTB1123), такой возможности лишен, так как из-за разрушения биопленки этими ферментами у блохи не происходит формирования блока преджелудка. Использовать выявленную особенность для дифференциации этих близких в генетическом, но далеких в экологическом отношении возбудителей по их N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности не предлагалось.

Известны способы идентификации и дифференциальной диагностики, которые предполагают использование различных вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения специфических фрагментов генов cafl (плазмида pFra), pla (плазмида pPst) и lcrV (плазмида pCad) чумного микроба, серологических методов (МФА, ИФА, РНат, РНаг) на продукцию видоспецифического капсульного антигена Ф1 и других антигенов или фенотипических признаков (ферментация углеводов, тест на уреазу, ауксотрофность, отношение к фагам и др.) (см.4).

Однако проведение ПЦР требует соответствующего оборудования, специалистов, что отражается на стоимости лабораторных исследований и длительности их проведения (не меньше 2 суток).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является тест-система «ГенПест» для выявления ДНК Y. pestis методом полимеразной цепной реакции (см. 5).

К исследуемым образцам культур добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 0,01% с последующим прогреванием их при 56°C в течение 30 мин. После этого 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата и инкубируют 15 мин при температуре 65°C. Выделение ДНК, проведение ПЦР осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест-системы «ГенПест».

Однако известная тест-система требует много времени (4-5 часов) и затрат на дорогостоящее оборудование, реактивы, сертифицированной лаборатории и специалистов, что усложняет способ дифференциации.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа, позволяющего в ускоренном режиме и наглядном воспроизведении осуществлять дифференциацию культур генетически родственных Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis в условиях in vitro.

Поставленная задача достигается тем, что способ дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза по N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности включает следующие стадии:

а) получение суспензии агаровой культуры исследуемых бактерий в концентрации (1-5)×10⁹ м.к.;

б) подготовку синтетического субстрата, для этого в его качестве берут субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид в количестве 50 мкМ, который растворяют в 2 мл диметилформамида,

затем из полученного раствора берут 0,6 мл и добавляют к нему 9,4 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4;

в) смешивание приготовленного субстрата в количестве 20 мкл с каплей 0,05 мл суспензии агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе, помещенной в чашку Петри;

г) инкубирование полученной смеси при 37°С в течение 10-20 мин, после этого реакцию останавливают добавлением 5 мкл 10 н. раствора щелочи;

д) дифференцирование в УФ-лучах трансиллюминатора при 366 нм, при этом яркая флюоресценция голубого цвета свидетельствует о положительном результате реакции, которая проявляет N-ацетил-β-D-глюкозаминидазную активность и подтверждает, что исследуемый штамм гидролизует подготовленный субстрат, поэтому его идентифицируют как штамм Yersinia pseudotuberculosis, а отсутствие свечения подтверждает его принадлежность к штаммам Yersinia pestis.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения дифференциации исследуемые культуры in vitro проходят соответствующие стадии.

Первоначально на чашки агара Хоттингера с pH 7,2 петлей высевают в отдельности исследуемые штаммы возбудителей чумы и псевдотуберкулеза для получения суспензии агаровых культур бактерий в концентрации (1-5)×10⁹ м.к. Затем проводят инкубирование в течение 24-48 часов при 28°C.

После этого готовят синтетический субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (4-MUF. GlcNAc, Sigma). Субстрат в количестве 50 мкМ растворяют в 2 мл диметилформамида. Из полученного раствора берут 0,6 мл и добавляют к нему 9,4 мл 0,1 М фосфатного буфера с pH 7,4.

Затем приготовленный субстрат в количестве 20 мкл смешивают с каплей 0,05 мл суспензии агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе, помещенной в чашку Петри.

После этого проводят инкубирование в течение 10-20 мин при 37°С, затем реакцию останавливают добавлением 5 мкл 10 н. раствора любой щелочи.

Дифференциацию полученных проб осуществляют путем просмотра проб в УФ-лучах трансиллюминатора при 366 нм.

Таким образом, исследуемый штамм гидролизует субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид, проявляя при этом N-ацетил-β-D-глюкозаминидазную активность, поэтому его идентифицируют как штамм Yersinia pseudotuberculosis. Если свечения нет, то подтверждают факт отсутствия гидролиза и соответственно отсутствие N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности, в результате чего делают вывод, что штамм является Yersinia pestis.

Вывод: N-ацетил-β-D-глюкозаминидазную активность штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis рассматривают как дифференциальный признак.

Пример 1.

В качестве исследуемых штаммов использовали 14 культур Y. pseudotubeculosis разных серотипов и из разных источников выделения. Все они обладали N-ацетилглюкозаминидазной активностью (см. таблица 1). Стадии проведения способа описаны выше. В качестве субстрата использовали 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (4-MUF. GlcNAc, Sigma) в количестве 20 мкл.

Учет результатов приведен в таблице 1, из которой видно, что N-ацетил-β-D-глюкозаминидазная активность обнаруживается у всех взятых в

исследование культур. Следовательно, они относятся к виду Yersinia pseudotuberculosis.

Пример 2.

Для изучения были взяты 22 музейных штаммов (коллекция Ростовского-на-Дону противочумного института) другого представителя рода Yersinia - Y. enterocolitica, которые также эффективно расщепляли предложенный субстрат (см. таблица 2). Технология проведения способа такая же, как в примере 1. Все штаммы обладали N-ацетилглюкозаминидазной активностью. В качестве субстрата использовали 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид в количестве 20 мкл.

Из таблицы 2 видно, что N-ацетил-β-D-глюкозаминидазная активность обнаруживается у всех взятых в исследование культур. Таким образом, можно дифференцировать исследуемые штаммы как не Yersinia pestis.

Пример 3.

Исследовали коллекцию из 50 штаммов чумного микроба основного и неосновных подвидов, хранившихся в лиофилизированном состоянии в музее живых культур РПЧИ. Штаммы были выделены в разных природных очагах чумы бывшего СССР и мира, в разные годы и от разных носителей. Технологические стадии проведения способа такие же, как в примере 1,2.

В результате ни один из штаммов не обладал способностью гидролизовать синтетический субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (4-MUF. GlcNAc, Sigma) в количестве 20 мкл (см. таблица 3). Из таблиц 1,2 видно, что у всех проверенных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica, независимо от серотипа, места, времени и источника выделения, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазная активность обнаруживается, тогда как 50 штаммов чумного микроба из разных природных очагов были лишены способности расщеплять синтетический субстрат.

Вывод: провести дифференциацию по исследуемому признаку возможно.

Использование предлагаемого изобретения позволяет проводить в ускоренном режиме, а именно в течение 10-20 мин, и наглядном воспроизведении дифференциацию Yersinia pestis от Yersinia pseudotuberculosis в условиях in vitro, что позволяет этот способ использовать как экспрессную диагностику при эпидемической ситуации и мониторинге больших территорий, так как дает экономию во времени, играющую большое значение для принятия экстренных санитарно-эпидемических решений.

Источники информации

1. Enzyme nomenclature -1984, р. 313.

2. Номенклатура ферментов. Москва. 1979, с.148.

3. Erickson D.L., Jarrett C.O., Callison J.A., Fischer E.R., Hinnebusch B.J. Loss of a biofilm-inhibiting glycosyl hydrolase during the emergence of Yersinia pestis. J. Bacteriol., 2008, v. 190, N 24, p. 8163-8170.

4. Brubaker R.R. The recent emergence of plague: a process of felonious evolution. Microbial Evolution, 2004, v. 47, p. 293-299.

5. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство/Под ред. академика РАМН, проф. Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН проф. В.В. Кутырева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009, с. 21-61.

Способ дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза по N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности предусматривает получение суспензии агаровой культуры исследуемых бактерий в концентрации (1-5)×10⁹ м.к., подготовку синтетического субстрата, в качестве которого используют 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид в количестве 50 мкМ. Субстрат растворяют в 2 мл диметилформамида. Из полученного раствора берут 0,6 мл и добавляют 9,4 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4. Смешивают 20 мкл подготовленного субстрата с каплей 0,05 мл суспензии агаровой культуры бактерий в физрастворе, помещенной в чашку Петри. Полученную смесь инкубируют 10-20 мин при 37°C, после чего реакцию останавливают добавлением 5 мкл 10 н. раствора щелочи. Осуществляют дифференцирование в УФ-лучах трансиллюминатора при 366 нм. Яркая флюоресценция голубого цвета свидетельствует о положительном результате реакции и подтверждает, что исследуемый штамм гидролизует подготовленный субстрат и принадлежит к Yersinia pseudotuberculosis. Отсутствие свечения подтверждает принадлежность штамма к Yersinia pestis. Изобретение обеспечивает экспресс-диагностику и дифференциацию указанных бактерий, а именно в течение 10-20 мин. 3 табл., 3 пр.

Способ дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза по N-ацетил-β-D-глюкозаминидазной активности, включающий следующие стадии:
а) получение суспензии агаровой культуры исследуемых бактерий в концентрации (1-5)×10⁹ м.к.;
б) подготовку синтетического субстрата; для этого в его качестве берут субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид в количестве 50 мкМ, который растворяют в 2 мл диметилформамида, затем из полученного раствора берут 0,6 мл и добавляют к нему 9,4 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4;
в) смешивание приготовленного субстрата в количестве 20 мкл с каплей 0,05 мл суспензии агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе, помещенной в чашку Петри;
г) инкубирование полученной смеси при 37°C в течение 10-20 мин, после этого реакцию останавливают добавлением 5 мкл 10 н. раствора щелочи;
д) дифференцирование в УФ-лучах трансиллюминатора при 366 нм, при этом яркая флюоресценция голубого цвета свидетельствует о положительном результате реакции, которая проявляет N-ацетил-β-D-глюкозаминидазную активность и подтверждает, что исследуемый штамм гидролизует подготовленный субстрат, поэтому его идентифицируют как штамм Yersinia pseudotuberculosis, а отсутствие свечения подтверждает его принадлежность к штаммам Yersinia pestis.