ШТАММ БАКТЕРИЙ Yersinia enterocolitica, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ УМЕРЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ЛИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ О1, О3, О12 СЕРОВАРОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12N7/01 C12R1/01 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий Yersinia enterocolitica, используемого в лабораторной диагностике в качестве индикаторной культуры для выявления умеренных фагов лизогенных штаммов иерсиний O1, O3, O12 сероваров.

При идентификации патогенных микроорганизмов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза значительное место принадлежит определению фагочувствительности. Сведения о фагах Y.enterocolitica немногочисленны. Поиск и изучение новых иерсиниозных бактериофагов, активных в отношении штаммов 35 разных сероваров, наиболее часто вызывающих заболевания кишечным иерсиниозом (O1, O3, O12 сероваров), остается актуальной проблемой, так как отсутствуют охарактеризованные индикаторные культуры для выявления умеренных бактериофагов.

Известен штамм бактерий Vibrio cholerae O42 серовара, используемый для получения вирулентного фага 781 (781В) С-170 042/1 серовара (См. А.с.СССР №1405298, кл. 12 №1/20, 22.02.1988 г.).

Однако использовать его для обнаружения бактериофагов Y. enterocolitica не представляется возможным, так как штамм энтеропатогенного вибриона 42 серовара лизируется только специфическим фагом O42/1.

За прототип выбран способ обнаружения фагов Y.enterocolitica (см. статью Гурлева Г.Г. и др. «Бактериофагия и бактериоциногения Yersinia enterocolitica», Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1979, №4, С.9-13), заключающийся в выявлении бактериофагов в фильтратах бульонных культур, выращенных в течение 24 часов, причем выявляют фаги в культурах с использованием хлороформного метода и выращивают культуры при 25°С.

Недостатком известного способа является то, что использовать для обнаружения бактериофагов в лизогенных штаммах Y.enterocolitica определенных сероваров не представляется возможным. Штамм-индикатор содержит собственный бактериофаг, присутствие которого после размножения свежевыделенных фагов приводит к контаминации дополнительным вирусом исходной расы, что полностью исключает возможность применения индикатора для новых фагов.

Кроме того, индикаторный штамм не охарактеризован по биологическим свойствам, а отсутствие антигенной характеристики тест-культуры не позволяет ее использовать целенаправленно с маркированными по серовару лизогенными бактериями, что увеличит время и объем работы по поиску фагов для диагностики возбудителя иерсиниоза.

Таким образом, известный фагочувствительный штамм по перечисленным признакам не соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам-менторам, обеспечивающим эффективный выход диагностических фагов, и не позволяет его использовать для фагов серотипированных лизогенных штаммов, что снижает эффективность лабораторной диагностики.

Цель изобретения - изыскание нового штамма - ментора Yersinia enterocolitica, способного выявлять умеренные фаги лизогенных штаммов O1, O3, O12 сероваров и повысить эффективность его лабораторной диагностики.

Поставленная цель достигается получением штамма бактерий Yersinia enterocolitica KM-206 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемого в качестве индикаторной культуры для выявления умеренных фагов ФК-99, ФК-100, ФК-101 (Центр депонирования бактериофагов Рост НИПЧИ) лизогенных штаммов O1, O3, O12 сероваров.

Штамм Yersinia enterocolitica 2012 выделен от человека (Бельгия), получен от доктора Mollaret в 1966 году музеем живых культур РостНИПЧИ. Штамм депонирован под номером КМ-206 (в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»). Штамм КМ-206 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Подвижные при 22°С палочки, имеют жгутики, грамотрицательны. Спор и капсул не образуют. На плотной питательной среде (агар Хоттингера, pH 7,2) образует мелкие, выпуклые, прозрачные колонии через 18-20 часов выращивания при 25-28°С. В бульоне Хоттингера pH 7,2, дает равномерное помутнение среды.

Физиолого-биохимические свойства. Тест на оксидазу отрицательный. Разлагает до кислоты без газа глюкозу, маннит, сахарозу, глицерин, ксилозу, сорбит, не активен к рамнозе, лактозе, рафинозе. Проба на уреазную активность -, Кристенсен ++++. Питательные потребности - прототроф. Отношение к видовым диагностическим сывороткам - биотип 3. Антигенные свойства штамма - серотип O3.

Отношение к гомо- и гетерологичным фагам. Штамм лизируется фагами, изолированными из лизогенных культур Yersinia enterocolitica 1, 3, 12 сероваров и устойчив к фагам: диагностическому чумному Л-413С, диагностическому чумному Покровской (П), диагностическому псевдотуберкулезному фагу. Штамм устойчив к пенициллину 1000 ед/мл; оксацилину 2500 ед/мл; левомицетину 10 ед/мл; тетрациклину 5 ед/мл. Штамм является индикаторным для фагов V морфогруппы. Титры фагов, размноженных на штамме, составляют n·10⁷-n·10⁸ частиц/мл. Штамм КМ-206 размножается в бульоне и на агаре Хоттингера (pH 7,2), хранят его в лиофилизированном состоянии. Способен выявлять и обеспечивать репродукцию умеренных фагов. С помощью штамма КМ-206 изолированы фаг 1998 - выделен из лизогенного штамма Y. enterocolitica 1 серовара, фаг 1999 - из штамма Y. enterocolitica 12 серовара; фаг 2010 - из штамма Y. enterocolitica 3 серовара.

Бактериофаги депонированы в Центре депонирования бактериофагов Ростовского НИПЧИ под номерами: ФК-99 (фаг 1998), ФК-100 (фаг 1999), ФК-101 (фаг 2010).

Характеристика свойств бактериофагов

Умеренные фаги формируют на газоне штамма КМ-206 негативные колонии типичной морфологии. Колонии умеренных фагов имеют мутные и полупрозрачные негативные колонии, около 1 мм в диаметре.

По электронно-микроскопической структуре фаги относятся к V морфологической группе по классификации А.С.Тихоненко. Они имеют многогранную головку и отросток, чехол которого способен к сокращению.

По своей литической активности фаги имели сходный диапазон действия, лизируя 31,7% штаммов Y.enterocolitica. В группе штаммов O3 серовара этот процент у фагов 1998 и 1999 составляет 83,1 из 77 изученных культур. Те же фаги (1998 и 1999) характеризуются способностью лизировать 1,7% штаммов O1 серовара и 0,4% - O12 серовара. Фаг 2010 лизирует 30% штаммов O3 серовара. Фаги обладают практически ценным свойством специфически лизировать штаммы Y.enterocolitica, что может быть использовано при лабораторной диагностике кишечного иерсиниоза.

Спектр действия фагов показан в таблице 1. Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

Пример. Подтверждение индикаторных свойств штамма 2012 (КМ-206) в отношении умеренного фага 1998 (ФК-99), фагов 1999 (ФК-100) и 2010 (ФК-101), которые выявляют методом Грациа и капли.

Фаги получают поэтапно: первоначально фильтруют суточную бульонную культуру штамма Y.enterocolitica ФК-99 или другого штамма ФК-100, ФК-101, исследуемого на лизогению. Далее в количестве 1,0 мл смешивают с 0,5 мл бульонной культуры суточного роста штамма 2012 и 4,5 мл 0,7%-ного агара Хоттингера (предварительно расплавленного и охлажденного до 45°С) и выливают на пластинку 1,5% агара Хоттингера в чашке Петри. После застывания нанесенного слоя чашку перевертывают и культивируют при 25°С 18-20 часов (метод Грация).

Затем вторым этапом бульонную культуру суточного роста штамма 2012 вносят в количестве 0,5 мл в 4,5 мл 0,7%-ного агара Хоттингера, тщательно перемешивают и выливают на поверхность пластинки 1,5%-ного агара Хоттингера в чашке Петри. На застывшую поверхность наносят каплю исследуемого фильтрата. При наличии небольшого количества корпускул фага в фильтрате он обнаруживается методом Грациа в виде изолированных негативных колоний на газоне штамма 2012. При высокой концентрации фага в фильтрате его обнаруживают методом капли в виде сливного литического пятна на газоне штамма 2012 на месте нанесения фильтрата.

Для окончательного выделения фага отбирают негативные колонии уколом платиновой иглы, из нее переносят в 0,1 мл бульона Хоттингера и концентрируют на твердой среде по методу Адамса с применением в качестве штамма-ментора Y.enterocolitica 2012. Полученный концентрат фага размножают в жидкой среде на штамме 2012. К 50,0 мл бульона Хоттингера добавляют суточную бульонную культуру штамма в количестве 1 мл (5·10⁸ микробных тел в 1 мл) и концентрат фага из расчета множественности инфекции 0,01. Посев культивируют при 25°С 18-20 часов, после чего стерилизуют фильтрацией через бактериальные стерильные миллипоровые фильтры с размером пор 0,2 мкм, контролируют на стерильность и применяют по назначению. Концентрация частиц препарата фага, размноженного в указанных условиях, равна 10⁷-10⁸ частиц на 1 мл.

Использование выделенных фагов у Yersinia enterocolitica на предлагаемом индикаторе КМ-206 обеспечивает дополнительную дифференциацию лизогенных культур от нелизогенных и повышает эффективность лабораторной диагностики Y.enterocolitica.

Кроме того, одновременно выделенные фаги и охарактеризованный фагочувствительный штамм могут использоваться в генетических исследованиях Y. enterocolitica, а также в качестве биологического инструмента для углубленного изучения свойств и поверхностных структур Y.enterocolitica и дифференциации от близкородственных микроорганизмов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике штаммов Yersinia enterocolitica, с применением умеренных бактериофагов ФК-99, ФК-100, ФК-101 для внутривидовой дифференциации возбудителя иерсиниоза. Штамм Yersinia enterocolitica 2012 выделен от человека в 1966 г. и депонирован под номером КМ-206 в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». При использовании его в качестве штамма-ментора концентрация частиц препаратов фагов равна n·10-n·10 частиц/мл. Использование выделенных фагов у Yersinia enterocolitica на предлагаемом по изобретению индикаторе КМ-206 обеспечивает дополнительную дифференциацию лизогенных культур от нелизогенных и повышает эффективность лабораторной диагностики Yersinia enterocolitica. 1 табл.

Штамм бактерий Yersinia enterocolitica KM-206 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемый в качестве индикаторной культуры для выявления умеренных фагов ФК-99, ФК-100, ФК-101 (Центр депонирования бактериофагов Рост НИПЧИ) лизогенных штаммов O1, O3, O12 сероваров.