Способ определения изоэлектрической точки белка Советский патент 1990 года по МПК G01N21/00 

Изобретение относится к молекулярной биофизике и предназначено для измерения характеристик белков-протеинов, а именно их изоэлектрических точек.

Целью изобретения является повышение чувствительности и точности определения изоэлектрической точки белков.

Сущность способа заключается в следующем.

Облучают среду, содержащую макромолекулы поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную (1) и деполяризованную (I.) компоненты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка (С), затем определяют зависимость коэффициента деполяризации (и j), экстраполяризованного к нулевой концентрации белка,

от рН раствора и по положению экстремума этой зависимости находят значения рН, соответствующие изоэлектрической точке белка.

На чертеже представлены графики зависимости коэффициентов деполяризации от рН раствора для водных растворов Х-глобулийа и сывороточного альбумина (HSA). Из приведенных экспериментальных зависимостей видно, что для альбумина (1) экстремум зависимости коэффициента деполяризации от рН соответствует ,7, а для Х-гло- булина (2) - рН 6,1.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают серию образцов растворов исследуемых белков в стандартных стеклянных кюветах с уменьшающейся концентрацией (исходные значения

сл J

оо

СП

СО

концентраций не более нескольких %) и различными значениями рН раствора. На установке, предназначенной для измерения интенсивности поляризованного и деполяризованного излучения, с лазерным источником света, фотоэлектрической регистрацией и поляризационным устройством (призмы Воллас- тона и Глана-Томсона) производят измерения поляризованной и деполяризованной компонент света, рассеянного от образцов белковых растворов под углом регистрации -90°, Строят график зависимости отношения интенсивностей деполяризованной (1) и поляризованной (1л) компонент от концентрации белка (С) и рН раствора. Положение экстремума этой .зависимости (dj f(рН) при С - 0 определяет значение pri, соответствующее изоэлектрической точке белка.

Падающая на рассеивающую среду монохроматическая световая волна Е 0-е J индуцирует в молекуле переменный дипольный момент , где t/ - поляризуемость молекулы. Для совершенно изотропных молекул / является скаляром, и основной вклад в интенсивность рассеянного излучения в растворах макромолекул дает рассеяние на флуктуациях концентрации.

В общем случае, когда рассеивающий объем обладает оптической анизотропией, поляризуемость определяет соотношение величин и ориентации в пространстве двух векторов - напряженности электрического поля Е и индуцированного дипольного момента р, к описывается тензором второго ранга, называемым тензором поляризуемости.

Если падающий и рассеянный лучи лежат в горизонтальной плоскости и составляют угол 90°, причем падающий луч поляризован в вертикальной плоскости, флуктуации ориентации оптической анизотропии молекул приведут к появ-« лению в рассеянном излучении горизонтальной поляризованной составляющей. Отношение интенсивности деполяризо- ванной и поляризованной составляющих рассеянного излучения называется коэффициентом деполяризации. /5 , где Т и I - горизонтально и вертикально поляризованные компоненты рас- сеянного излучения. Зарядовые свойства поверхности макромолекул белков определяют их электронную поляризуемость, которая является основным физическим параметром в явлении рэлеев- ского рассеяния. При перезарядке молекул с изменением рН среды резко возрастает интенсивность рассеянного света, связанного с флуктуациями концентрации растворов. При этом должны изменяться и поляризованные характеристики среды, связанные с флуктуациями ориентации анизотропных молекул. Различный знак производной приведен ; ных на чертеже зависимостей для альбумина и т-глобулина может быть объяснен различием в распределении электронной плотности у поверхностных групп белковых макромолекул.

Q Таким образом, предлагаемый способ отличается от прототипа повышенной чувствительностью, а также более высокой точностью определения изоэлектрической точки белка.

5 При осуществлении данного способа могут быть использованы стандартные установки, применяющиеся для измерения интенсивности рассеянного света, требуется очень малое количество исходного вещества, не требуется использования охлаждающей системы, падающее на среду излучение не вносит возмущения и не изменяет параметров белка.

Формула изобретения

Способ определения изоэлектрической точки белка, основанный на измерении рН среды, содержащей белковые макромолекулы, отличающийся ; тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения, облучают среду, содержащую белковые макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компоненты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка, затем определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполяризованного к нулевой концентрации белка, от рН раствора,и по положению экстремума этой зависимости находят значение рН, соответствующее 5 изоэлектрической точке белка.

0

0

5

0

1

11 рН

Изобретение относится к молекулярной биофизике и предназначено для измерения характеристик белков-протеинов. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения изоэлектрической точки белков-протеинов. Для этого облучают среду, содержащую макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компоненты рассеянного света при различных PH среды и различных концентрациях раствора белка, затем определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполированного к нулевой концентрации белка, от PH раствора, по положению экстремума этой зависимости находят значения PH, соответствующие изоэлектрической точке белка. 1 ил.