Способ определения активности протеолитических ферментов Советский патент 1990 года по МПК G01N21/75 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения активности ферментов, и может быть использовано для определения активности ферментов и содержания амин- ного азота в аминокислотном анализе и протеолизе.

Целью изобретения является повьше- ние чувствительности способа определения .

Активность проте олитических ферментов определяют следуюидим образом: проводят реакцию гидролиза белкового субстрата под действием анализируемого фермента, останавливают реакцию при помощи трихлоруксусной кислоты, центрифугируют реакционную смесь, в супернатанте определяют концентрацию аминогрупп при помощи хромогенной реакции с нингидрином в среде метилцел- лозольва с добавлением метабисульфита натрия, тетрафтордибромэтана и три - этиламмония и фотометрируют окрашен- ньй раствор при длине волны 570 нм.

Пример., Для проведения реакции гидролиза используют растворы трипсина 0,5 мг/мл и гемоглобина 10 мг/мл в 0,05 М ацетатном буфере с

СП

;с 1 -vj

рН 4,5. Раствор для гидролиза субстра-- та содержит 0,2 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 4,5 с 10 м14 ЭДТА, 0,2 мл раствора фермента, 0,1 мл раствора гемоглобина (субстрат). После инкубации при 30°С в течение 60-120 мин реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 10%- ного раствора трихлоруксусной кислоты Реакционную смесь центрифугируют при 10000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 0,1-0,2 мл супернатанта, которые переносят в стеклянные пробирки, куда добавляют среду для определения количества свободных аминокислот. Эта среда содержит 0,18 г нингидрина, растворенного в 4,2 мл ацетатного буфера с рН 5,5, 7,2 мл метил целлозольва (этот реактив готовят непосредственно перед определением активности), а также метабисульфит натрия, тетрафтор- дибромэтан и триэтилалюминий. После добавления нингидринового реагента пробирки прогревают 10 мин при 95 С на водяной бане до получения устойчи- вой фиолетовой окраски. Экстинкцию замеряют при 570 нм на спектрофотометре. По разнице поглощения опытных и контрольных пробирок судят об активности фермента.

На фиг. 1 приведена кривая изменения протеазной активности в зависимости от добавления к метилцеллозольву различных количеств метабисульфита натрия;,на фиг. 2 - кривая изменения протеазной активности в зависимости от добавления к метилцеллозольву различных количеств тетрафтордибромэта- на (ТФБЭ); на фиг. 3 - кривая изменения протеазной активности в зависимо- сти от добавления к метилцеллозольву различных количеств триэтиламмония. Как видно из данных, приведенных на фиг. 1, минимальная концентрация, приводящая к эффекту, составляет 0,4 мг/мл, а максимальная - 5,0 мг/м При концентрациях, превьппающих

5,0 мг/мл, действие этого соединения остается на прежнем уровне, что объясняется количеством связываемых им перекисей, находящихся в метилцелло- зольве. Оптимум составляет 2,5 мл/мл. Минимальная концентрация определяется достоверностью получаемых данных (уровень значимости Р :0,2), максимальная - выходом кривой на плато. Оптимум концентрации - первая точка при входе кривой на плато. Как и в случае с метабисульфитом натрия, определены концентрации тетрафтордибром этана: минимальная 0,02 мг/мл, максимальная 0,25 мг/мл и оптимальная 0,1 мг/мл (фиг. 2).

Минимальная концентрация алюмоорга нического соединения, необходимая для достижения положительного эффекта, составляет 0,6 мг/мл, максимальная - 4,0 мг/мл и оптимальная - 2,5 мг/мл (фиг. 3).

Чувствительность способа, измеренная по способности достоверно детектировать присутствие аминокислот (на примере глицина) в растворе, составляет 0,1 мкг/мл.

Формула изобретения

Способ определения активности про- теолитических ферментов, включающий введение образца исследуемой реакционной смеси в растворитель, содержащий метилцеллозольв, ацетатный буфер с рН 4,5-5,5 и нингидрин при заданном объемном соотношении образец:растворитель, протекание хромогенной реакции и фотометрирсвание,- отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, растворитель содержит дополнительно мета- .бисульфит натрия в концентрации 0,4 - 5 мг/мл, тетрафтордибромэтан в концентрации 0,02-0,25 мг/л и триэтилам- моний в концентрации 0,6-4,0 мг/мл.

2,5 5,0 7,5 1Q.Q

.r/M/i фиг. 1

0,25 0,5 Q.7S 1,Q

тетрафтордиЗронзтан.

Фиг.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения активности ферментов, и может быть использовано для определения активности ферментов и содержания аминного азота в аминокислотном анализе и протеолизе. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Активность протеолитических ферментов определяют следующим образом. Проводят реакцию гидролиза белкового субстрата под действием анализируемого фермента, останавливают реакцию при помощи трихлоруксусной кислоты, центрифугируют реакционную смесь, в супернатанте определяют концентрацию аминогрупп при помощи хромогенной реакции с нингидрином в среде метилцеллозольва с добавлением метабисульфита натрия, тетрафтордибромэтана и триэтилалюминия и фотометрируют окрашенный раствор при длине волны 570 нм. Минимальные, максимальные и оптимальные концентрации равны 0,4, 5 и 2,5 мг/мл для метабисульфита натрия, 0,02, 0,25 и 0,1 мг/мл для тетрафтордибромэтана и 0,6, 4 и 2,5 мг/мл для триэтилалюминия. 3 ил.

2.5 5.Q 7,5 10,0

М(СгН5 з1иг/М/1

Фаг.з