Способ получения пепсина Советский патент 1992 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу комплексного получения препарата пепсина из внутренних органов рыб, которые могут найти применение в научно-исследовательской деятельности, медицине, пищевой и кожевенной промышленностях.

Пепсин (КФ 3.4.23.1)- протеаза, эффективно гидролизующая пептидные связи белков при кислых значениях рН. Наиболее хорошо изученными являются пепсины млекопитающих. Хотя активность пепсина ранее обнаружена и у рыб, фермент из данного источника изучен недостаточно.

Известны способы получения пепсина из таких рыб как треска, сельдь, анчоус, мойва, кета. В большинстве случаев в качестве сырьевого источника были использованы

желудки. Выделение пепсина из этих источников включает гомогенизацию, центрифугирование, фракционирование белков сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гельфильтрацию в различных сочетаниях и различной последовательности. К недостатку описанных методов очистки относят ее многостадийность, что приводит к значительным потерям фермента и невысоким значениям выхода. Кроме того, недостатком является использование в качестве сырья выбранных из общей массы внутренних органов желудков, что делает данный процесс нетехнологичным.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения пепсина рыб. Всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе рН 2-6, инкубируют 3-20 ч при

VI

ю со

ю

CJ

комнатной температуре и центрифугируют 30 мин при 19000д, 4°С. Для активации пеп- синогена рН гомогената доводят до 1,7-2,4 и инкубируют 15-300 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000д 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элю- ируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка. Выход по активности равен 30-87%.

Недостатками являются невысокая удельная активность пепсина, низкая технологичность процесса за счет применения стадии ионообменной хроматографии.

Цель изобретения - повышение удельной активности пепсина и упрощение его технологического процесса. .

Поставленная цель достигается тем, что всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют, после чего супернатант используют для получения пепсина. К су- пернатанту приливают трет-бутиловый спирт в соотношений I - (0,3-1), а затем добавляют сульфат аммония, осаждая сначала балластные вещества при концентрации 12-17%, а затем высаливая пепсин при концентрации 35-45%. Сформировавшийся осадок, содержащий пепсин, растворяют в 5 мМ ацетатном буфере, рН 5,0. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4-5 с помощью раствора ацетата натрия, после чего для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500-3700 ед/мг белка. Выход по активности равен 55-60%.

В предложенном способе активность целевого препарата пепсина увеличивается до 3500-3700 единиц на 1 мг белка, упрощается способ очистки за счет удаления стадии ионообменной хроматографии.

Верхняя граница величины объемного отношения гомогената к трет-бутиловому спирту обусловлена тем, что при соотношении выше 1:1 наблюдается инактивация фермента в присутствии органического растворителя.

Нижняя граница величины объемного отношения гомогената к трет-бутиловому

спирту обусловлена тем, что при соотношении ниже 1:0,3 наблюдается понижение выхода очистки и не удается полностью освободиться от липидов.

Верхняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации выше 45% наблюдается дополнительное соосаж- дение балластных белков, что приводит к

0 понижению удельной активности целевого продукта.

Нижняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации ниже

5 35% не удается количественно выделить пепсин.

Верхняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концент0 рации выше 17% наблюдается дополнительное соосаждение пепсина, что приводит к понижению выхода целевого продукта.

Нижняя граница концентрации суль5 фата аммония при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концентрации ниже 12% не удается полностью отделиться от примесных веществ.

Предлагаемый способ заключается в

0 следующем. 200 г внутренних органов рыб гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют в 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супер- натанта приливают трет-бутиловый спирт

5 (соотношение 1:0,3-1), а затем добавляют сульфат аммония до концентрации 12-15%, растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбра0 сывают, а в водноорганическую смесь вновь добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45%, перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в

5 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсиногена раствор доводят до рН 2 с помощью 2 н HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до

0 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину 3500-3700

5 ед/мг белка. Выход по активности 55-60%. Пример 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супернатанта приливают 200 мл трет-бутилевого спирта (соотношение 1:0,3), Ј затем добавляют 102 г сульфата аммония (концентрация 12%), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавляют еще 195,5 г сульфата аммония (концентрация 35%), перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсино- гена рН раствора доводят до 2 с помощью 2 н HCI и инкубируют30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С, Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3700 ед/мг белка. Выход по активности 59%.

П р и м е р 2. 200 г внутренних органов трески гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супернатанта приливают 650 мл трет-бути- лового спирта (соотношение 1:1), а затем добавляют 195,0 г сульфата аммония (концентрация 15%), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавляют еще 325,0 г сульфата аммония (концентрация 40%), перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсино- гена раствор доводят до рН 2 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 5,0 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500 ед/мг белка. Выход по активности равен 60%.

П р и м е р 3. 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл

супернатанта приливают 325 мл трет-бути- лового спирта (соотношение 1:0,5), а затем добавляют 165,75 г сульфата аммония (концентрация 17%), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин

при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавляют еще 273 г сульфата аммония (концентрация 45%), перемешивая до полного растворения и центрифугируя

вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсиногена рН раствора доводят до 2 с помощью 2 н. НС и инкубируют 30 мин при комнатной

температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,0 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельная

активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3620 ед/мг белка. Выход по активности равен 55%.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить удельную активность

продукта, а также упростить технологический процесс и тем самым повысить его экономичность.

35

Формула изобретения

Способ получения пепсина, включающий гомогенизацию внутренностей рыб, отделение ферментсодержащего раствора, очистку, активацию целевого продукта и его

выделение, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта и упрощения способа, очистку и выделение ведут путем последовательного добавления к ферментному

раствору трет-бутилового спирта в соотношении 1:(0,3-1), сульфата аммония в концентрации 12-17%, затем в концентрации 35-45%, а активацию проводят после выделения целевого продукта.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу комплексного получения препарата пепсина из внутренностей рыб. Цель - повышение удельной активности целевого продукта и упрощение способа. Для осуществления способа всю массу внутренних органов рыб гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют. К супернатанту последовательно приливают третбутиловый спирт в соотношении 1-(0,3-1), а затем сульфат аммония, осаждая пепсин в интервале концентраций между 12-17% и 35-45%. Сформировавшийся осадок, содержащий пепсин, растворяют в 5 мМ-ацетатном буфере, рН 5,0. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4-5 с помощью раствора ацетата натрия, после чего для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500-3700 ед/мг белка. Выход по активности равен 55-60%. СО С