Способ получения препаратов субклеточных фракций туляремийного микроба Российский патент 2019 года по МПК A61K39/02 C12N1/02 G01N33/50 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам выделения антигенных компонентов клетки туляремийного микроба, и может быть использовано для изучения ферментативной активности поверхностных структур туляремийного микроба, разработки диагностических препаратов и средств специфической профилактики туляремии.

Несмотря на достижения в изучении туляремийного микроба, далеко не все известно о механизмах, участвующих в адаптации и персистенции его в окружающей среде, а также об особенностях реализации патогенных свойств возбудителя. Изучение ферментного спектра поверхностных структур туляремийного микроба представляет интерес для более полной характеристики возбудителя туляремии, актуальным остается вопрос разработки безопасных профилактических средств против туляремии.

Одним из подходов для выделения антигенов бактериальной клетки является перевод ее в гомогенезированное состояние, применяя способы, обусловленные строением клеточной стенки объекта исследования. Применяются растирание с абразивом, шаровые мельницы, продавливание прессом, ультразвуковая обработка, применение хаотропных агентов, детергентов, органических растворителей, ферментов и т.д. При этом исследователи, работая с гомогенатами клеток, сталкиваются с процессом модификации бактериального материала высвобождающимися гидролазами. Для уменьшение этого процесса в гомогенат добавляют ингибиторы гидролаз, устанавливают рН среды для сохранения стабильного состояния получаемого материала. Работа с микроорганизмами I-II групп патогенности, к которым относится и туляремийный микроб, требует биологическую защиту исследователя и окружающей среды (СП 1.3.3118-13), что предусматривает инактивацию патогенного материала с помощью общепринятых способов: прогревание, обработка фенолом или формалином.

В качестве одного из способов получения отдельных субклеточных фракций белковой и небелковой природы используют экстракцию влажных клеток раствором трихлоруксусной кислотой (ТХУ) (Кэбот Е., Мейер М. Антигены типа Буавена // Экспериментальная иммунохимия. - М.: Медицина, 1968. - С. 549-557) или сухих микробных клеток (Freeman G.G. at al., 1940). Белки при этом выпадают в осадок, а экстракт содержит кислоторастворимые полисахариды.

Используется прямой метод экстракции соматических антигенов энтеробактерий жидким фенолом, перемешивая целые бактериальные клетки в нагретой до (65-68)°С смеси равных объемов фенола и воды большая часть которых разрушается, а соматические структуры диссоциируют в раствор (Адамс Г. А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Методы исследования углеводов: Пер. с англ. - М.: Мир, 1975. - С. 126-130). Экстракты из микробных клеток, полученные обоими способами, сохраняют антигенную активность в серологических тестах. Однако ТХУ и фенол очень токсичны: при попадании на кожные покровы вызывают химические ожоги, оказывая гепатотоксическое действие.

Экстракты, приготовленные при помощи продавливания клеток в прессе, под воздействием ультразвука или при обработке лизоцимом получаются вязкими из-за присутствия в них высоких концентраций ДНК, что создает трудности при работе с гомогенатом. Для снижения вязкости нуклеиновые кислоты можно осаждать протаминсульфом или стрептомицином. В результате адсорбции на образующемся осадке теряется часть белков. Либо вязкость раствора можно снижать введением в раствор нуклеаз, что требует последующего избавления от вводимых в гомогенат реагентов.

Также известен способ получения тулярин-лизата (препарата для скарификационной пробы) обработкой микробной массы дезоксихолатам натрия в течение двух часов при 37°С для экстракции антигенов туляремийного микроба с последующим прогреванием в течение 10 минут при 90°С для обеззараживания микробной массы и центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут (Брикман Д.И., 1971).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения специфического белково-липополисахаридного антигена туляремийного микроба (SU 1692580 А1, МПК А61К 39/02, 23.11.1991 г.), где используют взвесь вирулентных клеток возбудителя туляремии штамма Francisella tularensis 777, выращенного на плотной питательной среде в течение 48 часов при 37°С. Культуру смывают стерильным 0,9% раствором хлорида натри рН 7,2 и готовят микробную взвесь в концентрации 20 млрд. микробных клеток по ОСО мутности ГИСК имени Л.А. Тарасевича. К полученной взвеси стерильно добавляют 1% твина 80 до конечной концентрации, выдерживают два часа при 37°С и прогревают 10 минут при 90°С на водяной бане при периодическом перемешивании. Полученную бактериальную массу проверяют на стерильность и при отсутствии специфического роста проводят центрифугирование при 10000 g в течение 30 минут для освобождения от неразрушенных клеток. Супернатант, содержащий экстрагированные антигены туляремийного микроба, подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение двух часов при 4°С. Образовавшийся осадок ресуспендируют в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,5 с добавлением 2% додецилсульфата натрия и проводят гель-фильтрацию на колонке с сефакрилом S-300, уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буфером в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Препарат элюируется этим же буфером под контролем проточного спектрофотометра. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, диализуют и осаждают добавлением к раствору десяти объемов охлажденного этанола. Осадок собирают центрифугированием в течение 40 минут при 6000 g, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивают.

Однако описанный выше способ, в силу своего воздействия на свойства получаемого препарата путем термической обработки, исключает возможность анализа их ферментативной активности, что диктует необходимость не только подбора способа выделения, но и способа инактивации бактериальной массы с минимальным воздействием на свойства получаемых препаратов.

Заявляемое изобретение лишено перечисленных выше недостатков. В предлагаемом способе для получения субклеточных фракций туляремийного микроба, как патогенного микроорганизма, объединяются этапы инактивации и разрушения микробной клетки, что позволяет работать с биологически безопасным материалом, экономить время за счет сокращения этапов и манипуляций в работе. Бактериальную массу туляремийного микроба обрабатывают концентрированным водным раствором мочевины, предварительно подвергнутым стерилизации. При нагревании водных растворов выше 100°С мочевина частично разлагается на двуокись углерода и аммиак, придающий получаемому гомогенату клеток щелочную реакцию, и в условиях высокой концентрации мочевины при рН 9,5-10 протеолиз не представляет серьезной проблемы, так как активность протеаз очень низка. Концентрированный аммиак используется для выделения ферментов из дрожжей методом цитолиза (Практикум по биохимии: Учеб. пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С. 264-266).

Целью изобретения является разработка способа получения субклеточных фракций туляремийного микроба, пригодных для исследования ферментативной активности препаратов штаммов разной подвидовой принадлежности.

Результат изобретения достигается тем, что культуру F. tularensis, культивируют при 37°С на плотной питательной среде, смывают физиологическим раствором и готовят суспензию с концентрацией 40 млрд. м. к./мл к которой приливают раствор мочевины (готовят 9 М раствор и стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм. в течение 30 мин, двукратно). Суспензию перемешивают и инкубируют ночь при комнатной температуре. На следующий день ставится контроль специфической стерильности лизата высевом на плотную питательную среду. На период проведения контрольных тестов в течение шести суток лизат хранится при +4°С. После бактериологического контроля лизат центрифугируют для избавления от неразрушенных клеток при 10000 g в течение 30 минут. Полученный супернатант подвергают дифференциальному центрифугированию и полученные субклеточные фракции диализуют от мочевины против проточной и дистиллированной воды в течение трех суток и лиофильно высушивают.

Возможность использования данного способа получения субклеточных фракций туляремийного микроба установлена нами экспериментальным путем и не известна из доступных источников информации.

Осуществление заявленного изобретения подтверждается следующим примерами.

Пример 1. Бакмассу F. tularensis subsp.holarctica 15 НИИЭГ выращивают в матрацах со скошенным FT-агаром в течение 48 ч при температуре 37°С. После инкубирования в матрацы вносят по 5 мл охлажденного 0,86% раствора хлористого натрия и стерильно смывают культуру с поверхности FT-агара. Смыв переносят в колбу и по ОСО мутности раствором хлористого натрия доводят концентрацию до 40 млрд м. к./мл. Бактериальную массу смешивают с 9 М раствором мочевины в соотношении по объему 1:1 и инкубируют при комнатной температуре в течении 24 часов. После контроля лизата на стерильность, неразрушенные клетки отделяют путем центрифугирования при 10000 g 30 мин, полученный супернатант центрифугируют один час при 40000 g, +4°С. После удаления супернатанта осадок переосаждают в деионизованной воде трижды при том же режиме центрифугирования.

Осадок ресуспендируют в деионизованной воде и лиофильно высушивают, хранят при +4°С.

Изучение суммарной протеазной активности препаратов проводят в тесте радиальной энзимодиффузии на чашках Петри: 1 мг препарата суспендируют в 1 мл 50 мМ Трис-HCl буфера рН 8,3. Образцы в количестве 50 мкг в объеме 50 мкл вносят в лунки, сделанные в 1% агарозном геле, приготовленном на 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,3 и содержащем 0,5% раствора желатина в качестве субстрата для протеаз. Для положительного контроля используют препарат коммерческой протеазы, для отрицательного контроля используют буфер растворения образцов. Чашки Петри ставят во влажную камеру при 37°С на ночь. После инкубации регистрацию результатов (размер зон гидролиза) проводят посредством стереоскопического микроскопа МБС-10, используя окуляр с увеличением 8^× со шкалой.

Препараты вакцинного штамма 15 НИИЭГ полученного предложенным способом проявляют активность в виде зон просветления размером (13,5±2,2) мм (р<0,05).

Пример 2. Бакмассу F. tularensis subsp. holarctica И-214 выращивают и выделяют препарат субклеточной фракции, как описано в примере 1.

Препараты из штамма F. tularensis subsp.holarctica И-214 проявляют в тесте радиальной энзимодиффузии в 1% агарозном геле, содержащем 0,5% раствор желатина - субстрата для протеаз, суммарную активность в виде зон гидролиза в (29,5±3,6) мм (р<0,05).

Пример 3. Бакмассу F. tularensis subsp. novicida И-384 выращивают и выделяют препарат субклеточной фракции, как описано в примере 1.

Препараты из штамма F. tularensis subsp.novicida И-384 проявляют в тесте радиальной энзимодиффузии в 1% агарозном геле, содержащем 0,5% раствор желатина - субстрата для протеаз, суммарную активность в виде зон гидролиза в (12,5±2,2) мм (р<0,05).

Пример 4. Бакмассу F. tularensis subsp. tularensis И-386 выращивают и выделяют препарат субклеточной фракции, как описано в примере 1.

Препараты из штамма F. tularensis subsp. tularensis И-386 проявляют в тесте радиальной энзимодиффузии в 1% агарозном геле, содержащем 0,5% раствор желатина - субстрата для протеаз, суммарную активность в виде зон гидролиза в (10,5±2,2) мм (р<0,05).

Пример 5. Бакмассу F. tularensis subsp. novicida И-385 выращивают и выделяют препарат субклеточной фракции, как описано в примере 1.

Препараты из штамма F. tularensis subsp. novicida И-385 проявляют в тесте радиальной энзимодиффузии в 1% агарозном геле, содержащем 0,5% раствор желатина - субстрата для протеаз, суммарную активность в виде зон гидролиза в (18,00±2,8) мм (р<0,05).

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна» предъявляемому к изобретениям, т.к. совокупность признаков и достигаемый технический результат не выявлен из исследованного уровня техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. оно не является очевидным для специалиста в данной области техники вследствие того, что до даты подачи настоящей заявки в исследованной области науки отсутствуют препараты субклеточных фракций, обладающие ферментативной активностью в реакции радиальной энзимодиффузии и субстратном электрофорезе, полученных известными методами, тогда как фракционирование, разработанное в заявленном техническом решении, обеспечивает получение антигенных препаратов, которые в реакции с субстратами проявляют ферментативную активность против различных субстратов, характерных для протеаз и других гидролаз. Разные результаты ферментативной активности субклеточных фракций из разных штаммов и подвидов туляремийного микроба отражают индивидуальные особенности штаммов.

Таким образом, предлагаемый способ независимо от вирулентности и подвида туляремийного микроба позволяет получать из микробных клеток препараты субклеточных фракций, в отличие от прототипа, с сохранением ферментативной активности, на основании которой можно оценивать изучаемые микроорганизмы. Способ прост в постановке, надежен и воспроизводим.

Литература:

1. Авторское свидетельство SU 1692580 А1, МПК А61К 39/02, 23.11.1991 г.

2. Брикман Д.И. О литическом действии дезоксихолата натрия на возбудителя туляремии. - Журн. микробиол. - 1971. - С. 141-143.

3. Практикум по биохимии: Учеб. Пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С. 264-266.

4. СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

5. Кэбот Е., Мейер М. Антигены типа Буавена // Экспериментальная иммунохимия. - М.: Медицина, 1968. - С. 549-557.

6. Freeman G.G., Challinor S.W., Wilson J. The use of a synthetic medium in the isolation of the somatic antigens of Bact. typhimurium and Bact. typhosum // Bio-chem. J. - 1940. - V. 34 (3). - P. 307-324.

7. Адамс Г.А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Методы исследования углеводов: Пер. с англ. - М.: Мир, 1975. - С. 126-130.

Изобретение относится к способу получения препаратов субклеточных фракций туляремийного микроба, включающему получение путем выращивания культуры Francisella tularensis с последующей ее инактивацией, отделением от низкомолекулярных примесей, выделением целевого продукта. Способ характеризуется тем, что препарат, полученный предложенным способом, может использоваться для изучения ферментативной активности, для чего инактивацию и дезинтеграцию бактериальной массы независимо от подвидовой принадлежности проводят стерильным раствором мочевины путем смешивания бактериальной массы в концентрации 40 млрд м. к./мл и 9 М раствором мочевины в соотношении по объему 1:1 при комнатной температуре в течение 24 часов, очистку препарата проводят дифференциальным центрифугированием. Преимущество предлагаемого способа заключается в простоте, воспроизводимости для штаммов разной подвидовой принадлежности и вирулентности, снижении трудоемкости и затрат времени за счет сокращения этапов в работе, дает возможность работать с обеззараженным биологическим материалом, сохраняющим ферментативную активность. 5 пр.

Способ получения препаратов субклеточных фракций туляремийного микроба, включающий получение путем выращивания культуры Francisella tularensis с последующей ее инактивацией, отделением от низкомолекулярных примесей, выделением целевого продукта, отличающийся тем, что препарат, полученный предложенным способом, может использоваться для изучения ферментативной активности, для чего инактивацию и дезинтеграцию бактериальной массы независимо от подвидовой принадлежности проводят стерильным раствором мочевины путем смешивания бактериальной массы в концентрации 40 млрд м. к./мл и 9 М раствором мочевины в соотношении по объему 1:1 при комнатной температуре в течение 24 часов, очистку препарата проводят дифференциальным центрифугированием.