Способ получения цианидгидратазы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения цианид- гидратазы № 4.2.1.66 (известный также под названием формамидгидролиа- за).

Цель изобретения - повышение активности целевого продукта.

Способ заключается в подборе условий ферментации продуцирующего фермент микроорганизма и добавлении в продессе культивирования к культуре цианид-ионов и/или цианистого водорода, что обеспечивает преврапгение их в цианистоводородную кислоту5и предусматривает использование таких бактериальных микроорганизмов и грибков, как Stemphylum loti АТСС 11718, Мусо- leptodisciis terrestris CBS 231 53, Fusarium raoniforme CBS 16182, Hel- minthosporiun sorghicola CBS 2.49.40,

Peniconia .circinata CBS 263 37, Glo- merella tucamanensis CBS 132.37.

Предпочтительным штаммом является Fusarium latiritium Nees

CM1 3005333, непатогенный no отношению к пшенице и обладающий следую- характеристиками.

Морфологические характеристики. Среда (I) Potato Sucrose Agar (PSA). 250 г промытого и нарезанного картофеля помещают в котел и выдерживают в не.м при давлении 15 фунтов на 1 KB, дюйм в течение 15 мин. Отвар процеш вают через два слоя муслина, добавляют к мутному фильтрату 2% глюкозы и 2% агара, выдерживают сре- дУ в автоклаве и диспергируют.

(2) Czapek-Dox (моди|5ицированный) агар (Oxoid)(СПА).

05

о

tsD

СО СО 4

Ы

Oxoid - зарегистрированный тованый знак.

Условия культивации:25 С, несколько недель.

Скорость роста: 4,0 см за 3 дня, 3,0 см за 3 дня соответственно.

Характеристика роста: хлопьевид- ноопушенно разрастаюпр1еся колонии с белым возДугага 1м мицелием. Субстрат на PSA серовато-розовый с пятнами малинового цвета, переходящего в желтый, несколько более бледный на CDA. Иногда образуется пигмент темно-красного цвета, в частности при старении Через одну-две недели воздушный мицелий приобретает коричневую окраску и разрушается. Колония при этом становится довольно слизистой, образуются спосодохии,, от розового до коричневого цвета на PSA и оранжево-розового на CDA.

Выделение жидкости не происходит. Цвет образующегося пигмента обычно такой же, как и мицелия.

Конидии. Микроконидии в случае этого организма не образуются. Мик- роконидйи образуются из однолатераль ных фиалид .или мультиразветвлен- ных конидиофор с короткими фиалида- ми. В более старых культурах конидио форы аггрегируют с образованием спо- .Р.ОДОХИЙ, в частности, на CDA. Форма конидий может изменяться от серповидной до.искривленной fusoid. спинно- брюшной, q количеством перегородок 3-5, обычно 5 в более молодых, культурах. Размер спор находится в пределах (25-30)х(2,5-4,0) мкм.

Опорная клетка часто имеет ножку в частности в случае спор с более чем 5 перегородками., В мицелии попадаются набухшие клетки, иногда встречаются хламидоспоры, интеркалярные, одиночные или звеньями,

Грибки могут расти двух различных формах, шарообразной или гра- нулообразной, а также в дисперсной форме, когда они представляют собой диффузные волокнистые пряди,диспергированные в питательной среде. При использовании для обработки материалов важно, чтобы грибки росли в дисперсной, а не в шарообразной или гранулообразной форме. Поскольку ро в гранулообразной форме тормозится за счет диффузии питательных вещест и газов через гранулы, процесс культивации в этом случае является не

j 0

5

Q

5

5

0

5

эффективным. Условия культиванд и предлагаемого способа должны быть благоприятными для роста грибков в дисперсионной форме.

Грибковый штамм может быть выращен в условиях кислородного или углеродного контроля. Предпочтительными являются условия, корда эффективный рост осуществляется при одновременном кислородном и углеродном контроле . В качестве питательной среды используют среду определенного состава:, а именно содержащую помимо источника углерода минеральные соли без добавок каких-либо неопределенных органических материалов, таких как дрожжевой экстракт.

В качестве источника углерода для осуществления предлагаемого способа можно использовать любой подходящий источник. Предпочтительно использовать для этой цели глюкозу. Источником азота являются сульфат и гидроокись аммония, а источником фосфора г- .фосфат калия и фосфорная кислота. Основные компоненты питательной среды используемой при осуществлении предлагаемого способа, содержатся в ней в следующих количествах, г: HjPO 10-20 Ml-t

K2.S04.800-1400

MgS04-7H.2.f 700-1200 Глюкоза «Н 10000-40000 (NH4)2S04 500-3000 Микроэлементы 0,1-20 Оптимальная питательная среда, вводимая в культуру в стащюнарных условиях, имеет следующий состав, ,

1,1 М Н РОф320 МП/20 л

Шкроэлементы и

биотин10 МП/20 л

K S0420/20

MgSO. 18/20

Глюкоза«Н О223/20

(NH)2S0450/20

Состав раствора микроэлементов и биотина.(в растворе на 1 л), г: FeClj-eHj O9,6

CuS04 5H.2,03,6

MnS04 4H2030,0

,0

Биотин, г0,52

Л 1анид-ионы или цианистоводород- ная кислота вводятся в культуру отдельно или вмес;те с другими питательными веществами на стадии культивации

предлагаемого способа, Предпочтител

но цианиды, добавляют к питательной среде, вводимой в культуру, в виде 1 1анидов щелочного металла, например циа нида калия или натрия. В начале стадии культивации цианиды добавляют в неболыштх количествах, торые затем, по мере приспособления к ним клеток грибка в культуре, постепенно увеличивают и в уясе устано- вивишхся стационарных условиях вводят в концентрации как минимум 15 ммоль в расчете на общее количесво питательной среды в культуре (т. в расчете на суммарное количество всех жидких питательных веществ в культуре), предпочтительно в количестве 10, наиболее предпочтительно 4-6 ммоль/г сухих клеток. Обнаружено, что с ростом концентрации цианид-ионов в питательной среде, вводмой в культуру в стационарны-х условиях, увеличивается активность фермента 1щанидгидратазы, причем величина его активности линейно зависит от концентратами цианид-ионов. Так, например, активность ферманта, выраженная в микромолях образую цегося в 1 мин на 1 л культуры формамида, при небольшом содержании (20 ммоль) равна 220.

Предпочтительным являются следую и«ие условия культивации предлагаемого способа: скорость разведения 0,05-0,1 ч- , рН 5,0-5,0 предпочтительно 5,5; те тература 28-32 0, предпочтительно 30-32°С. В этих ч сло виях активность получаемого фермантл максимальна.

}.

В процессе культивации, культура неггрерывно отводится из ферментатора, в котором проводится культивация. Клетки, содержащие фермент цианид гидратаз у, отделяют от выводимой из ферментатора культуры люб),1м под- ходя1 1 1м способом, предпочтительно путем фильтрации. Отделенные клетки могут 6i,iTb в -1су1чены и подвергнуты затем дальнейшей обработке, например экструзии, для получения со- держагчего пиарпгл.гидратаз у кпеточного материала в любо; нужной форме, например, в виде агрегатов или порошка. Фермент может быть также отделен от клеток и использоваться в чистом виде. Обычно в этом нет необходимости, поэтому, как правило, фермент не отделяют от клеток.

10

20

4

Содержатц;ий цианидгидратазу материал, полученный по предлагаемому способу, может использоваться для обработки цианидсодержащих сточных вод. Полученный предлагаемым способом фермент обладает высокой стабильностью (период полураспада его, например, может составлять до 130 дней) и высокой активностью. Высокостабильный ферментосодержащий материал может быть получен, если стадию культивации предлагаемого способа проводить в условиях кислородного или одновременно кислородного и углеродного контроля. Фермент, содержащий материал с высокой активностью, может быть получен при проведении стадии культивации предлагаемого способа при 30-32°С.

Пример 1. Цианидгидратазу получают путем культиващш гатамма Fusarium СМ1 300533 в присутствии HCN непрерывным способом, вводя в 25 культуру питательную среду указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят в стационарных условиях при различных температурах, рН 5,5 и сксг- рости разбавления О,10 Полученные результаты сведены в табл. 1, из которой видно, что максимальная активность фермента достигается при температуре культивации 30-32 0, а при более низких температурах получаемая активность вдвое меньше мак- 5 симальной. При температуре выше 34°С роста культуры не происходит. Активность фермента выражена в микромолях формамида, получаемого в минуту из 100 ммоль натрия при рН 8,5.

П р и м е р 2. Пиаш-щгидратазу получают путем культивации штамма Fusarium latiritiura СМ1 300533 в присутствии HCN непрерьшным способом, вводя в культуру питательную среду указанного состава на глюкозе. Культива1Д1ю проводят в стационарных условиях при различной скорости окисления и постоянных рН (5,5), температуре (30°С) и скорости разбавления (0,10 ч). Образующийся фермент подвергают сублимационной сушке и хранят при 4°С над. силикагелем. Стабильность полученного фермента контролируют путем анализа аликвотных 5 проб через определенные промежутки времени.

Полученные результаты сведены в табл. 2, из которой видно, что ста30

40

5

10

15

20

25

бильность фермента при хранении возрастает, если культивация проводится при одновременном кислородном и углеродном контроле.

Примерз. Индукционный профиль цианидгидратазы определяют путем культиватщи штамма Fisarium СМ1 300533 непрерывным способом, вводя в культуру питательную среду, указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят в стационарных условиях при различных концентрациях HCN, поддерживаяпостоянными рН (5,5), температуру () и скорость разбавления (0,10 ч ).

На чертеже приведен график линейной зависимости между индукп рован- ной активностью и концентраи ей цианида .

Линейность сохраняется До концентрации цианида в питательной среде как минимум 24 ммоль..На графике по оси ординат отложена номинальная концентрация цианида, а по оси абсцисс общая активность.

П р и м е р 4 .Штамм Fusarium СМ1 300533 Bbipвшивают непрерывным способом в емкости объемом 6000л с использованием питательной среды указанного состава; зо содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Скорость роста контролируют концентрацией глюкозы. рН поддерживают в пределах 5,0 и 5,8, скорость разбавления составляет 0,08- ,, 0,1 ч, температура 30-32 с. Цианид натрия добавляют к питательной среде в количестве 61,5-73,5 ммоль. Культивацию проводят в условиях кислородного голодания, для чего уменьшают интенсивность аэрирования. В результате происходит образование этанола в количестве 0,81 г/л. За 140 ч получено 12,2-14,3 г/л биомассы с активностью гр анидгидратазы 81,0 - 122,4 ед. т.е. 81.,0-122.,4 мкМоль формамида в 1 мин на 1 мг сухого веса (для анализа брали 120 ммоль раствора цианида при рН и температуре 20°С).

16023948

Формула изобретения

1. Способ получения циапидгидра- тазы, предусматривающий непрерывное культивирование в условиях аэрации продугц рующего фермент микроорганизма в водной питательной среде, содержащей источник углерода, приемпемый для данного микроорганизма, неорга- тшческие питательные вещества и раствор микроэлементов, при непрерывной подаче источника 11 {анид-ионов и/или цианистого водорода с послед уюпд;им вьиелением клеток, содержаний циа- нидгидратазу, отличающей- с я тем, что, с целью повьш1ения активности целевого продукта, культивирование ведут при 28-32°С, рН 4,5-7,5 и скорости разбавления среды в интервале 0,05-0,11 ч а минимальную концентрацию 1щанид-ионов и/или цианистого водорода, вводят в питательную среду, устанавливают не менее 15 ммоль.

2,Способ по п. 1,отличаю- Ш и и с я тем, что продуцируюпр м фермент микроорганизмом является штамм Fusarium latiritium Nees CMI 300. 533.

3.Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что источник и11анид- ионов и/или.цианистого водорода добавляют к культуре в количестве, эквивалентном 2-10 ммоль/г сухих клеток.

4.Способ.по п. 1, о т л и ч а ю- ш и и с я тем, что источник цианид- ионов и/или цианистого водорода добавляют в концентрации 4-6 ммоль/г сухих клеток.

5.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу.

6.Способ по п. 1,отличаю- дс Щ и и с я тем, что культивирование

ведут при рН предпочтительно 5,0-6,0.

7.Способ по п. 1, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что культивирование осуществляют предпочтительно при

40

30-32 0.

7.Спо щ и и с я осуществл

30-32 0.

1602394

10 таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Способ получения фермента цианидгидратазы включает непрерывную культивацию штамма микроорганизма при определенных температурах, PH и скорости разбавления, а также непрерывном введении в культуру цианид-ионов и/или цианистоводородной кислоты в концентрации не менее 15 мм. Фермент стабилен в течение до 130 дней. Предпочтительным микроорганизмом является штамм FUSARIUM LATERITIUM NEES CMI 300533, депонированный в соответствии с Будапештским соглашением в Микологическом институте здравоохранения, KEW, RICHMOND, SURREY, Великобритания. 6 з.п.ф-лы. 2 табл, 1 ил.

Оксигенация

Таблица2

Период полураспада, дн.

Аэробные условия Средняя аноксия Жесткая аноксия

21 63 90