Способ идентификации рыб и их гибридов Советский патент 1990 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно к способам, связанным с идентификацией рыб и их гибридов, а также для прижизненного генетического мониторинга природных и рыбозаводских популяций рыб.

Целью изобретения является исключение гибели рыб в процессе исследования и ускорение процесса.

Способ осуществляется следующим образом.

У исследуемых рыб прижизненно берут соскоб коллоидной ткани (слизь) с наружных поверхностей тела в количестве 0,5 мл и смешмвают с равным объемом 20%-ной сахарозы. Отмеряют 20 мкл этого раство|5а и подвергают его электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля, содержащего 0,003% флюоресцирующего субстрата 4-ме- тилумбеллиферилацетата, при напряжений 400-500 В в течение 5-10 мин, одновременно облучая электрофорезируемый гель пучком длинноволнового ультрафиолетового света. Выявляемые таким образом электрофореграммы видоспецифичного белка эстеразы Д, присутствующей в исследуемых образцах коллоидной ткани (слизь), сравнивают с известными стандартными злектрофорети- ческими вариантами эстеразы Д соответствующих вид рыб или их гибридов.

Слизь, как ткань, используют из-за наличия в ней белка эстеразы Д. Эстераза Д проявляет видовую специфичность. Присутствие в геле 4-метилумбеллиферилацетата дает возможность одновременно выполнять две операции, которые раньше осуществлялись последовательно - электрофорез и сканирование электрофорезируемого геля в ультрафиолетовом свете.

Наличие в геле флюоресцирующего субстрата обеспечивает образование фер- ментсубстратного комплекса эстераза Д 4-метилумбеллиферилацетат в самые первые минуты процесса электрофореза экстракта белков. В свою очередь, этот образовавшийся ферментсубстратный комплекс можно сделать видимым для регистрации, если на

ON

«од

«

со о

со

электрофорезируемый гель направить пучок длинноволнового ультрафиолетового

света.

При использовании предлагаемого способа затраты времени на проведение электрофореза и получение фл 00ресциругощ11х электрофореграмм сокращаются; вместо ;40 мин по прототипу он и составляют 10 мин по предлагаемому способу,

Пример 1, Отбирают из мест обитания 8 видов рыб. Сведения об исследованных рыбах приведены в табл.1.

У исследуемых особей с помощью глазного скальпеля берут соскоб коллоидной ткани (слизь) с хвостового плавника. Полученный образец этой ткани сг ешивают с равным объемом 20%-ной сахарозы и 20 /1кл этого белкового раствора вносят в лунку по- лиакриламидного геля, который содержит 0,003% флюоресцируюидего субстрата -ме- тилумбеллиферилацетатв. Затем в течение 10 мин на гель подают напряжение 500 В постоянного тока и одновременно облучают электрофорезируемый гель пучком длинноволнового ультрафиолетового света. При таком сканировании в геле видны четкие флюоресцирующие электрофоретмческие варианты эстеразы Д анализируемых видов рыб в виде дискретных полос, которые сопоставляют с известными стандартными электрофо- ретическими вариантами эстеразы Д этих видов,

На чертеже представлены результаты видовой идентификации . На чертеже изображено: 1 - атлантический лосось; П - кумжа; 111 - гибриды лосось х кумжа; IV - мино га; V - сингиль (кефаль); V.- плотва; VII - елец; VIII - карп.

П р и м е р 2. На рыбоводном заводе провели ряд индивидуальных скрещиваний между лососем (Salmo saiar L.) и кумжей (Salmo trutta L) с целью проведения генетического анализа на эстеразе Д. Для этого у отловленных в реке производителей-, находившихся в преднерестовом состоянии, с помощью скальпеля брали соскоб коллоидной ткани (слизь) с хвостового плавника. При этом к спинному плавнику каждой обследуемой особи прикрепляли подвесную метку, на которой указан порядковый номер. Затем его регистрировали в протоколе опыта. Взятый образец коллоидной ткани подвергали электрофоретическому анализу .и определяли видовую принадлежность данной пронумерованной особи способом, указанным в примере 1, Полученный ре- зультат видовой идентмф /ткации регистрировали в протоколе. Этим способом было проанализировано 8 рыб (производителей) - А лосося и 4 кумжи. Затем осуществляли

подбор родительских пар и проводили индивидуальные скрещивания по следующей схеме; 1) лосось х лосось; 2) кумжа х кумжа; 3) лосось X кумжа; 4) лосось х кумжа, Опло- дотворенную икру, полученную в каждом скрещивании, помещали на инкубацию в отдельные садки с тем, чтобы избежать ее случайного смешивания. Сразу же после оплодотворения икры молоками у родитель- ских особей были взяты навески скелетных мышц для осуществления видовой идентификации по прототипу. Затем сопоставляли результаты анализа коллоидной ткани (слизь) и скелетных 1чышц. этих родитель- ских особей.

Было обнаружено, что у каждой отдельной особи электрофоретические варианты эстеразы Д, полученные предложенным и известным способами, идентичны. Эти ре- зультаты были подтверждены также данными генетического анализа потомства, произведенного отуказанных родительских пар. После достижения потомством возра- стной стадии малек, оно было подвергнуто электрофоретическому анализу с целью выявления электрофореграмм зстеразы Д известным способом. Полученные у мальков электрофоретические варианты эстеразы Д в каждом отдельном скрещивании соответ- ствуют ожидаемым вариантам эстеразы Д, что наход /1тся в полном согласии с законами наследования дискретных качественных признаков и доказывает правильность идентификации родительских особей пред- лагаемым способом.

Результаты анализа родительских пар и их потомства приведены в табл,2.

40

Формула изобретения

Способ идентиф,икации рыб и их гибридов, включающий взятие у рыб образцов тканей, приготовление экстракта белков из этих тканей, электрофорез экстракта белков

5 3 полиакриламидном геле, инкубирование геля в растворе 4-метилумбеллиферилаце- тате, получение электрофореграмм путем сканирования геля в ультрафиолетовом свете и сопоставление последних со Стандарта0 ми, отличающийся тем, что, с целью исключения гибели рыб в процессе исследования и ускорения процесса, в качестве ткани для приготовления экстракта белков используют слизь, взятую путем соскоба с

5 наружной поверхности тела, а из полиакрил- амидного геля для электрофореза используют гели из полиакриламидного геля, . содержащего 4-метилумбеллиферилацетат, пш этом электрофорез и сканирование проводят одновременно,

Таблица 1

Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно способам идентификации рыб и их гибридов. Целью изобретения является исключение гибели рыб в процессе исследования и ускорение процесса. У исследуемых рыб берут соскоб слизи с наружных поверхностей тела, готовят экстракт белков и подвергают его электрофорезу в полиакриламидном геле, содержащем 4-метилумбеллиферилацетат, при этом электрофорез и сканирование проводят одновременно, затем сопоставляют полученные электрофореграммы со стандартами. 2 табл., 1 ил.

-производители;

-молодь.

Старт

Ж Ж Ж

Таблица 2

Ж Ш Ш