СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРАНИЦ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ БИОГЕЛЬМИНТОЗОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 B01D57/02 G06F17/15 

Изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» относится к области медицины, в частности в эпидемиологии, например, при осуществления противоэпидемических мероприятий, преимущественно на эндемичных по биогельминтозам территориях.

Известен способ определения породной принадлежности рыб посредством биологического маркера, содержащего полиморфную ДНК и характеризующий породную принадлежность, происхождение распространенных и практически значимых природных и одомашненных форм рыб семейства карповых и представляющий собой нуклеотидную последовательность из группы 5 пар праймеров, причем этот способ включает сбор образца крови, выделение ДНК из него, исследование геномной ДНК с помощью ПЦР, анализ которого проводят, используя набор контрольных амплификатов, содержащих образцы амплифицированной ДНК, характерные для каждой из изученных пород карповых рыб, получают полиморфные маркеры ДНК разного размера или длины, визуализируют эти ДНК при электрофорезе в акриламидном или агарозном геле, затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение генетического разнообразия определяемой и контрольной группы образцов амплифицируемой ДНК и по отсутствию или присутствию в исследуемой группе определенных единичных породоспецифических аллелей или аллельных сочетаний определяют породную принадлежность, при этом для каждой породы и породной группы рыб составляют генетический паспорт, в котором указано распределение 50-75 полиморфных микросателлитных маркеров, выявленных с помощью 5 пар праймеров по пяти соответствующим локусам, по которым определяют породу рыб.

Однако известный способ неэффективен при выявлении миграции стай рыбы, подверженной заражению биогельминтозом, в частности описторхозом, известный способ также не дает достоверности о нахождении всех популяций рыб хотя бы одного речного бассейна, подверженных заражению биогельминтозом, кроме того, определение ДНК по крови является дорогостоящим и трудоемким способом и по крови в рыбе не выявляется наличие гельминтов.

Данный недостаток обусловлен тем, что в исследуемых популяциях рыбы, выловленной в период нереста в бассейнах рек, не производят забор мышечной ткани в области спинного плавника, по которой можно выявить наличие гельминтов, методом вертикального электрофореза выявить полиморфные белковые фракции и провести расчет популяционно-генетических параметров для определения генетического маркера (индекса генетического подобия или сходства Нея), отражающего степень локальности популяции на обследованных территориях.

Известен принятый за прототип способ определения миграции популяции кеты, (см. ГЕНЕТИКА, 1997 год, том 33, №4, с.550-552, статья Е.В. Иванковой «Полиморфизм креатинкиназы в приморской популяции кеты (Река Киевка)», основанный на применении маркеров, когда по определенному маркеру для особей данной популяции кеты, например, в определенных реках определяют ее миграционный маршрут независимо от миграции популяции этой рыбы из других рек.

Однако известный способ неэффективен при выявлении миграции стай рыбы, например породы карповых, в районе больших речных бассейнов, в частности Обь-Иртышского речного бассейна, подверженной заражению биогельминтозом, в частности описторхозом, определяющим динамику цирроза печени и онкологических заболеваний печени и почек у населения в этом регионе.

Данный недостаток обусловлен тем, что популяция кеты, в частности зрелых особей, имеет очень ограниченный срок жизни, например до первого нереста, и не определяются наличие гельминтов и степень инвазии из-за ограниченности жизни зрелых особей. Кроме того, каждая особь кеты идет на нерест в протекающую вдали от населенных пунктов небольшую речку, где кета родилась и где она производит новое потомство, поэтому определять очаги миграции биогельминтозов по малым рекам неэффективно. Переносчиком биогельминтоза, в частности описторхоза, является рыба породы карповых, постоянно заселяющая в основном большие речные бассейны Сибири.

Техническим результатом заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» является снижение трудоемкости и себестоимости при одновременном повышении эффективности, точности и достоверности выявления границ миграции природных очагов биогельминтозов.

Поставленный технический результат достигается тем, что в заявляемом способе определения границ природных очагов биогельминтозов с использованием генетических маркеров согласно изобретению первоначально на обследуемых территориях отлавливают рыбу из различных районов речного бассейна, затем из выловленной рыбы производят забор мышечной ткани в области спинного плавника, которую гомогенезируют до получения однородной массы, после чего отбирают супернатант, подготавливают гель для вертикального электрофореза, далее проводят разделение белков мышечных тканей методом вертикального электрофореза и выявляют полиморфные белковые фракции, после этого по каждой выявленной полиморфной белковой фракции проводят расчет популяционно-генетических параметров и определяют генетический маркер и показатель индекса генетического подобия (или сходства Нея), отражающий степень локальности популяции на обследованных территориях, одновременно в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, а также определяют уровень инвазии, после этого по количественным характеристикам популяционно-генетических параметров сравнивают локальные популяции рыб в пределах обследованных территорий, отслеживают миграцию зараженных популяций рыб на определенных, ограничивающих данную миграцию территориях (Хомах), далее по сходству и различию популяционно-генетических параметров отслеживают возможные границы территорий популяции зараженной рыбы, т.е. природных очагов биогильментозов, причем отлов особей производят в период движения рыбы на нерест в Обь-Иртышском речном бассейне, при этом производят отлов рыбы породы карповых, в частности язя, для чего используют сетчатые орудия лова, производят с помощью скальпеля и пинцета забор мышечной ткани отловленной особи популяции рыбы для проведения вертикального электрофореза, подготавливают полиакриламидный гель (ПААГ), в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, в частности описторхоза, после определения возможных границ территории очага каждой зараженной популяции рыбы проводят противоэпидемиологические мероприятия среди населения.

Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь.

В отличие от аналога и прототипа в данном изобретении предложен способ определения границ природных очагов биогельминтозов, включающий в себя следующий ряд последовательных действий, при которых первоначально отлавливают рыбу из различных районов речного бассейна, где предполагают наличие популяций рыбы, несущей биогельминтоз, затем из выловленной рыбы производят забор мышечной ткани в области спинного плавника, которую гомогенезируют до получения однородной массы, после чего отбирают супернатант, подготавливают гель для вертикального электрофореза, в данном случае подготавливают полиакриламидный гель (ПААГ) - синтетический полимер, состоящий из двух мономеров - акриламида и метилен-бисакриламида, который обладает наибольшей разрешающей способностью и применяется для изучения как белков, так и нуклеиновых кислот. Далее в ПААГ проводят разделение белков мышечных тканей методом вертикального электрофореза и выявляют полиморфные белковые фракции, после этого по каждой выявленной полиморфной белковой фракции проводят расчет популяционно-генетических параметров и определяют генетический маркер и показатель индекса генетического подобия (или сходства Нея), отражающий степень локальности популяции на обследованных территориях, одновременно в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, а также определяют уровень инвазии, все это позволяет одновременно при взятии пробы определить и генетический маркер, и наличие гельминтов, и уровень инвазии, что значительно снижает себестоимость предложенного способа, определяет его эффективность, точность и достоверность, что особенно важно, поскольку это связано со здоровьем населения, основную часть питания которого составляет рыба. При сравнении локальных популяций рыб в пределах обследованных территорий отслеживают миграцию зараженных популяций рыб на определенных, ограничивающих данную миграцию территориях (Хомах), что позволяет своевременно предупреждать местное население об опасности тяжелого заболевания, которое несет данная зараженная популяция рыб. В совокупности признаков определение по сходству и различию маркеров возможных границ территорий популяции зараженной рыбы и определение по выявленным маркерам возможных границ природных очагов биогильментозов дает возможность быстро и своевременно провести противоэпидемиологические мероприятия среди населения и снизить процент заболеваемости тяжелых недугов, поскольку не нужно проводить постоянные исследования отловленных рыб, достаточно лишь отслеживать дальнейшую миграцию зараженной биогельминтозом стаи. Проведение отлова особей в период движения рыбы на нерест также позволяет повысить достоверность выявления гельминтов в популяции рыбы на данной территории, поскольку на нерест идет зрелая рыба, и, если она заражена, намного проще и быстрее определить наличие в ней гельминтов. Поскольку Обь-Иртышский речной бассейн является одним из регионов, где большая часть местного населения подвержена заражению страшным заболеванием - описторхозом, от поедаемой некачественно обработанной приготовленной рыбы породы карповых, отлов популяции рыбы производят в Обь-Иртышском речной бассейне, при этом отлавливают и исследуют различную рыбу, но чаще всего рыбу породы карповых, в частности язя, ельца, леща, с помощью сетчатых орудий лова, поскольку крупная ячея сети захватит только зрелых особей, что в совокупности признаков позволит снизить трудоемкость и себестоимость исследований при одновременном повышении эффективности, достоверности и точности выявления границ миграции природных очагов биогельминтозов. Следует заметить, что забор мышечной ткани отловленной особи популяции рыбы в области спинного плавника с помощью самых распространенных и простых инструментов скальпеля и пинцета снижает себестоимость способа, поскольку предопределяет простоту, быстроту и качество забора мышечной ткани с учетом того, что большинство личинок гельминтов, в том числе и описторхоз, находятся именно в области спинного плавника. При этом следует заметить, что определение ДНК по крови рыб как в объекте-аналоге, так и прототипе требует определенных дорогих инструментов, контейнеров, а сроки забора крови у отловленных рыб и ее хранение тоже ограничены, что в целом влияет на точность и достоверность результатов, кроме того, наличие большинства гельминтов, в том числе и описторхоза, по крови рыб не определяется. Дополнительным техническим результатом заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» является снижение процента заражения описторхозом населения и популяции рыбы, поскольку от человека личинками биогельминтоза заражается рыба, являющаяся переносчиком биогельминтоза, в частности описторхоза, человеку.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов», позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного технического решения. По имеющимся у заявителя сведениям, совокупность существенных признаков заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов», не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» критерию "новизна". Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволил выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявляемом изобретении «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов», изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» соответствует критерию "новизна".

Для проверки соответствия заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» критерию "изобретательский уровень" заявитель провел дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить совокупность признаков, совпадающих с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов». Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку из уровня техники, определенного заявителем, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявленного изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» преобразований для достижения технического результата. Следовательно, заявленное изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» соответствует критерию "изобретательский уровень".

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании в заявленном изобретении «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» совокупности условий в том виде, как заявляемое изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» охарактеризовано в формуле изобретения, т.е. подтверждена возможность ее осуществления с помощью описанного в заявке примера конкретного выполнения. Технологические приемы, воплощающие заявленное изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» при его осуществлении, способны обеспечить достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно снижение трудоемкости и себестоимости, при одновременном повышении точности, выявления очагов биогильментозов, следовательно, заявленное изобретение «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» соответствует критерию "промышленная применимость".

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов», может быть многократно использована в технологически нетрудоемком и очень быстром процессе определения параметров границ природных очагов биогельминтозов с получением технического результата, заключающегося в снижении трудоемкости и себестоимости, при одновременном повышении точности и достоверности, выявления очагов биогильментозов, что позволяет быстро и точно не только определить параметры границ природных очагов биогельминтозов в отдаленных регионах, но и осуществить противоэпидемические мероприятия, преимущественно на эндемичных по биогельминтозам территориях, одновременно снизить процент заболеваемости населения, а следовательно, и очагов распространения биогельминтоза.

Сущность заявляемого изобретения «Способ определения границ природных очагов биогельминтозов» поясняется рис.1, на котором изображена географическая карта части северного Урала и Западно-Сибирской низменности, где отражены места вылова рыбы, в частности язя (рыбу породы карповых), при реализации заявляемого способа.

Способ определения границ природных очагов биогельминтозов осуществляли следующим образом.

Способ основан на использовании явления полиморфизма белковых фракций аллозимных локусов в популяции рыб как промежуточных хозяев паразита, несущих инвазионное начало, и определении на этой основе территориальных границ их обитания, а следовательно, и границ природных очагов биогельминтов, в пределах которых происходит заражение человека через рыбу.

ПРИМЕР 1. Отлавливали язя в период продвижения рыбы на нерест на реке Северная Сосьва в районах: 1 - у поселка Пугоры, 2 - у поселка Сосьва, 3 - у поселка Хулимсунт. При этом в каждой упомянутой выше точке отлавливали по 30 зрелых особей язя (рыбу породы карповых) как основного носителя инвазионного начала (метацеркарий описторхов). При отлове зрелой особи язя как промежуточного хозяина паразита, являющегося носителем инвазийного начала (метацеркарий биогильментозов), использовали сетчатые орудия лова. Рыбу в каждой упомянутой выше точке отлавливали с трех участков, расположенных друг от друга на расстоянии 20 км, по ходу течения реки Северная Сосьва, включая притоки, пойменные озера, старицы. В каждой выборке у 30 взрослых особей отловленных рыб в области спинного плавника производили забор мышечной ткани для исследования, т.е. вырезали с помощью скальпеля кусочек мышечной ткани и с помощью пинцета, клали выделенную мышечную ткань в пробирку с 75% спиртовым раствором, на каждой пробирке с выделенной мышечной тканью язя фиксировали время и место отлова взрослой особи популяции язя. Выделенную мышечную ткань в пробирках доставляли в лабораторию для исследования, где ее гомогенезировали до получения однородной массы, после чего отбирали супернатант, затем готовили растворы и буферные смеси, белки мышц рыб подготавливали для вертикального электрофореза белков в геле, затем подготавливали полиакриламидный гель (ПААГ) - синтетический полимер, состоящий из двух мономеров - акриламида и метилен-бисакриламида, который обладает наибольшей разрешающей способностью и применяется для изучения как белков, так и нуклеиновых кислот. В ПААГ проводили разделение тканей белков мышц рыб методом вертикального электрофореза с последующим специфическим окрашиванием на ферментную активность, т.е. проводили выявление изменчивости частот полиморфных белков в популяции пойманной рыбы методом вертикального электрофореза макромолекул в полиакриламидном геле с последующей визуализацией. Следует заметить, что принцип вертикального электрофореза заключался в разделении смеси макромолекул белка на фракции под действием электрического поля. Известно, что скорость движения изучаемых макромолекул в ПААГ, находящихся в электрическом поле, зависит от размеров, форм и заряда, а различающиеся по характеристикам фракции белков оказываются на разном расстоянии от начала (старта). Для исследования белковых фракций рыб применяли специальные камеры для вертикального электрофореза. Изменчивость частот полиморфных белков в популяции рыб методом вертикального электрофореза определяли гистохимическим выявлением белков и расшифровкой электрофореграмм белков. Поскольку разные зоны активности одного и того же фермента (белка) соответствуют разным локусам, их обозначали по названию фермента и нумеровали в порядке уменьшения электрофоретической подвижности. Таким образом, выявляли полиморфизм белковых фракций, т.е. неоднородность белковых фракций, поскольку каждый белок маркируется определенным геном, то выявляли полиморфную белковую фракцию, так называемый генетический маркер, данной популяции. Далее проводили соответствующие измерения на электрофореграммах по каждому локусу, поскольку различные фракции в каждой из зон соответствуют аллелям данного локуса. Вслед за этим проводили расчет популяционно-генетических параметров, при этом по результатам электрофоретического анализа рассчитывали частоты аллелей популяции язя на реке Северная Сосьва, в упомянутых выше районах: 1 - у поселка Пугоры, 2 - у поселка Сосьва, 3 - у поселка Хулимсунт. Частота аллеля в этих районах составляла 0,461-0,476 (причем этот аллель более нигде не встречается). При расчете популяционно-генетических параметров по результатам электрофоретического анализа рассчитывали также наблюдаемые и ожидаемые частоты генотипов, долю полиморфных локусов и другие показатели, характеризующие в совокупности степень пригодности одного из ферментов в качестве генетического маркера, отражающего межпопуляционные различия и соответственно границы этих популяций, а значит, и очагов инвазии. По полученному полиморфному белковому маркеру проводили расшифровку и чтение электрофореграмм белков, также проводили расчет популяционно-генетических параметров, по которым определяли показатель индекса генетического подобия или сходства Нея (ИГП). В результате получали данные, характеризующие заметные статистические различия между популяциями по аллельным частотам изученных генетических локусов, и констатировали факт их обособленности в пределах пространственных границ водного бассейна, в данном случае в язе, выловленном из реки (у поселка Пугоры, у поселка Сосьва, у поселка Хулимсунт), показатель ИГП был равен 0,9801. Одновременно в исследуемых особях выявляли наличие паразитов, в частности описторхоза, а также определяли уровень инвазии у популяций рыб, который свойствен данной исследуемой популяции, в пределах границы очага. С учетом того, что миграция зараженных популяций рыб всегда ограничена определенной территорией (Хомом), по выявленному маркеру периодично (в период нереста) отслеживали миграцию зараженной популяции рыб, т.е. определяли возможные границы территории очага каждой зараженной популяции рыбы и своевременно проводили среди населения противоэпидемиологические мероприятия.

ПРИМЕР 2. Отлавливали язя в период продвижения рыбы на нерест на реке Обь в районах: 4 - у поселка Белогорья, 5 - у поселка Кедровый, 6 - у г. Нефтеюганск. При этом в каждой упомянутой выше точке отлавливали по 30 зрелых особей язя (рыбу породы карповых) как основного носителя инвазионного начала (метацеркарий описторхов). При отлове зрелой особи язя использовали сетчатые орудия лова. Рыбу в каждой упомянутой выше точке отлавливали с двух участков, расположенных друг от друга на расстоянии 35 км, по ходу течения реки Обь, включая притоки, пойменные озера, старицы. В каждой выборке у 30 взрослых особей отловленных рыб, в области спинного плавника, производили забор мышечной ткани для исследования, т.е. вырезали с помощью скальпеля кусочек мышечной ткани и с помощью пинцета, клали выделенную мышечную ткань в пробирку с 75% спиртовым раствором, на каждой пробирке с выделенной мышечной тканью язя фиксировали время и место отлова взрослой особи популяции язя. Выделенную мышечную ткань в пробирках доставляли в лабораторию для исследования, где ее гомогенезировали до получения однородной массы, после чего отбирали супернатант, затем готовили растворы и буферные смеси и белки мышц рыб подготавливали для вертикального электрофореза белков в геле, затем подготавливали полиакриламидный гель (ПААГ) - синтетический полимер, состоящий из двух мономеров - акриламида и метилен-бисакриламида, который обладает наибольшей разрешающей способностью и применяется для изучения как белков, так и нуклеиновых кислот. В ПААГ проводили разделение тканей белков мышц рыб методом вертикального электрофореза с последующим специфическим окрашиванием на ферментную активность, т.е. проводили выявление изменчивости частот полиморфных белков в популяции пойманной рыбы методом вертикального электрофореза макромолекул в полиакриламидном геле с последующей визуализацией. Следует заметить, что принцип вертикального электрофореза заключался в разделении смеси макромолекул белка на фракции под действием электрического поля. Известно, что скорость движения изучаемых макромолекул в ПААГ, находящихся в электрическом поле, зависит от размеров, форм и заряда, а различающиеся по характеристикам фракции белков оказываются на разном расстоянии от начала (старта). Для исследования белковых фракций рыб применяли специальные камеры для вертикального электрофореза. Изменчивость частот полиморфных белков в популяции рыб методом вертикального электрофореза определяли гистохимическим выявлением белков и расшифровкой электрофореграмм белков. Поскольку разные зоны активности одного и того же фермента (белка) соответствуют разным локусам, их обозначали по названию фермента и нумеровали в порядке уменьшения электрофоретической подвижности. Таким образом, выявляли полиморфизм белковых фракций, т.е. неоднородность белковых фракций, поскольку каждый белок маркируется определенным геном, то выявляли полиморфную белковую фракцию, так называемый генетический маркер, данной популяции. Далее проводили соответствующие измерения на электрофореграммах по каждому локусу, поскольку различные фракции в каждой из зон соответствуют аллелям данного локуса. Вслед за этим проводили расчет популяционно-генетических параметров, при этом по результатам электрофоретического анализа рассчитывали частоты аллелей популяции язя на реке Обь в упомянутых выше районах: 4 - у поселка Белогорья, 5 - у поселка Кедровый, 6 - у г. Нефтеюганск. Частота аллеля в этих районах составляла 0,861-0,929. При расчете популяционно-генетических параметров по результатам электрофоретического анализа рассчитывали также наблюдаемые и ожидаемые частоты генотипов, долю полиморфных локусов и другие показатели, характеризующие в совокупности степень пригодности одного из ферментов в качестве генетического маркера, отражающего межпопуляционные различия и соответственно границы этих популяций, а значит, и очагов инвазии. По полученному полиморфному белковому маркеру проводили расшифровку и чтение электрофореграмм белков, также проводили расчет популяционно-генетических параметров, по которым определяли показатель индекса генетического подобия или сходства Нея (ИГП). В результате получали данные, характеризующие заметные статистические различия между популяциями по аллельным частотам изученных генетических локусов, и констатировали факт их обособленности в пределах пространственных границ водного бассейна, в данном случае в язе, выловленном из реки Обь в районах: 4 - у поселка Белогорье, 5 - у поселка Кедровый, 6 - у г. Нефтеюганск Пугоры, показатель ИГП был равен 0,8399. Одновременно в исследуемых особях выявляли наличие паразитов, в частности описторхоза, а также определяли уровень инвазии, у популяций рыб, который свойствен данной исследуемой популяции, в пределах границы очага. С учетом того, что миграция зараженных популяций рыб всегда ограничена определенной территорией (Хомом), по выявленному маркеру периодично (в период нереста) отслеживали миграцию зараженной популяции рыб, т.е. определяли возможные границы территории очага каждой зараженной популяции рыбы и своевременно проводили среди населения противоэпидемиологические мероприятия.

ПРИМЕР 3. Отлавливали язя в период продвижения рыбы на нерест на реке Большой Салым в районе 7 - у поселка Лямпино, на реке Иртыш в районе 8 в устье реки Конда, на реке Конда 9 - у поселка Болчары, 10 - у поселка Кондинское, 11 - у поселка Междуреченск, на реке Тобол 12 - у поселка Иковское. Как и в предыдущих примерах, в каждой упомянутой выше точке отлавливали по 30 зрелых особей язя (рыбу породы карповых) как основного носителя инвазионного начала (метацеркарий описторхов). При отлове зрелой особи язя использовали сетчатые орудия лова. Рыбу в каждой упомянутой выше точке, отлавливали с двух участков, расположенных друг от друга на расстоянии 30 км, по ходу течения реки, включая притоки, пойменные озера, старицы. В каждой выборке у 30 взрослых особей отловленных рыб в области спинного плавника производили забор мышечной ткани для исследования, т.е. вырезали с помощью скальпеля кусочек мышечной ткани и с помощью пинцета, клали выделенную мышечную ткань в пробирку с 75% спиртовым раствором, на каждой пробирке с выделенной мышечной тканью язя фиксировали время и место отлова взрослой особи популяции язя. Выделенную мышечную ткань в пробирках доставляли в лабораторию для исследования, где ее гомогенезировали до получения однородной массы, после чего отбирали супернатант, затем готовили растворы и буферные смеси и белки мышц рыб подготавливали для вертикального электрофореза белков в геле, затем подготавливали полиакриламидный гель (ПААГ) - синтетический полимер, состоящий из двух мономеров - акриламида и метилен-бисакриламида, который обладает наибольшей разрешающей способностью и применяется для изучения как белков, так и нуклеиновых кислот. В ПААГ проводили разделение тканей белков мышц рыб методом вертикального электрофореза с последующим специфическим окрашиванием на ферментную активность, т.е. проводили выявление изменчивости частот полиморфных белков в популяции пойманной рыбы методом вертикального электрофореза макромолекул в полиакриламидном геле с последующей визуализацией. Следует заметить, что принцип вертикального электрофореза заключался в разделении смеси макромолекул белка на фракции под действием электрического поля. Известно, что скорость движения изучаемых макромолекул в ПААГ, находящихся в электрическом поле, зависит от размеров, форм и заряда, а различающиеся по характеристикам фракции белков оказываются на разном расстоянии от начала (старта). Для исследования белковых фракций рыб применяли специальные камеры для вертикального электрофореза. Изменчивость частот полиморфных белков в популяции рыб методом вертикального электрофореза определяли гистохимическим выявлением белков и расшифровкой электрофореграмм белков. Поскольку разные зоны активности одного и того же фермента (белка) соответствуют разным локусам, их обозначали по названию фермента и нумеровали в порядке уменьшения электрофоретической подвижности. Таким образом, выявляли полиморфизм белковых фракций, т.е. неоднородность белковых фракций, поскольку каждый белок маркируется определенным геном, то выявляли полиморфную белковую фракцию, так называемый генетический маркер, данной популяции. Далее проводили соответствующие измерения на электрофореграммах по каждому локусу, поскольку различные фракции в каждой из зон соответствуют аллелям данного локуса. Вслед за этим проводили расчет популяционно-генетических параметров, при этом по результатам электрофоретического анализа рассчитывали частоты аллелей популяции язя в упомянутых выше районах: на реке Большой Салым в районе 7 - поселка Лямпино, на реке Иртыш в районе 8 - устье реки Конда, на реке Конда в районах: 9 - у поселка Болчары, 10 - у поселка Кондинское, 11 - у поселка Междуреченск, на реке Тобол 12 - у поселка Иковское. Частота аллеля в этих районах составляла 0,416-0,587. При расчете популяционно-генетических параметров по результатам электрофоретического анализа рассчитывали также наблюдаемые и ожидаемые частоты генотипов, долю полиморфных локусов и другие показатели, характеризующие в совокупности степень пригодности одного из ферментов в качестве генетического маркера, отражающего межпопуляционные различия и соответственно границы этих популяций, а значит, и очагов инвазии. По полученному полиморфному белковому маркеру проводили расшифровку и чтение электрофореграмм белков, также проводили расчет популяционно-генетических параметров, по которым определяли показатель индекса генетического подобия или сходства Нея. В результате получали данные, характеризующие заметные статистические различия между популяциями по аллельным частотам изученных генетических локусов индекса генетического подобия или сходства Нея (ИГП), в данном случае в язе, выловленном из реки (п. Болчары, п. Кондинское, п. Междуреченский), показатель ИГП был равен 0,7522; в язе, выловленном из реки Иртыш в районе 8 в устье реки Конда, показатель ИГП был равен 0,8211, Тобол (у поселка Иковское) - показатель ИГП был равен 0,6556, выловленном из реки Большой Салым в районе 7 у поселка Лямпино.

Таким образом, констатировали факт обособленности между популяциями по аллельным частотам изученных генетических локусов ИГП в пределах пространственных границ водного бассейна. Одновременно в исследуемых особях выявляли наличие паразитов, в частности описторхоза, а также определяли уровень инвазии, у популяций рыб, который свойствен данной исследуемой популяции, в пределах границы очага. С учетом того, что миграция зараженных популяций рыб всегда ограничена определенной территорией (Хомом), по выявленному маркеру отслеживали миграцию зараженной популяции рыб и определяли возможные границы территории очага каждой зараженной популяции рыбы и проводили среди населения противоэпидемиологические мероприятия.

По проведенным исследованиям факта обособленности между популяциями по аллельным частотам изученных генетических локусов ИГП в пределах пространственных границ водного бассейна выводили дендрограммы популяции Leuciscus idus, построенные по индексам генетического сходства Нея.

Способ определения границ природных очагов биогельминтозов позволяет своевременно получать данные о распространении эпидемии и предупреждать население о возможности заражения опасными гельминтами, в частности описторхозом.

Изобретение относится к области медицины, в частности эпидемиологии, и предназначено для определения границ природных очагов биогельминтозов с использованием генетических маркеров. На обследуемых территориях отлавливают рыбу из различных районов речного бассейна. Из выловленной рыбы производят забор мышечной ткани в области спинного плавника. Мышечную ткань гомогенезируют до получения однородной массы, отбирают супернатант, проводят разделение белков методом вертикального электрофореза и выявляют полиморфные белковые фракции. По каждой выявленной полиморфной белковой фракции проводят расчет популяционно-генетических параметров и определяют генетический маркер и показатель индекса генетического подобия (или сходства Нея), одновременно в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, а также определяют уровень инвазии. По сходству и различию популяционно-генетических параметров в пределах обследуемых территорий отслеживают возможные границы природных очагов биогильментозов. Изобретение позволяет эффективно определять границы природных очагов биогельминтозов и осуществлять противоэпидемические мероприятия среди населения. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 пр.

1. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов с использованием генетических маркеров, отличающийся тем, что первоначально на обследуемых территориях отлавливают рыбу из различных районов речного бассейна, затем из выловленной рыбы производят забор мышечной ткани в области спинного плавника, которую гомогенезируют до получения однородной массы, после чего отбирают супернатант, подготавливают гель для вертикального электрофореза, далее проводят разделение белков мышечных тканей методом вертикального электрофореза и выявляют полиморфные белковые фракции, после этого по каждой выявленной полиморфной белковой фракции проводят расчет популяционно-генетических параметров и определяют генетический маркер и показатель индекса генетического подобия (или сходства Нея), отражающий степень локальности популяции на обследованных территориях, одновременно в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, а также определяют уровень инвазии, после этого по количественным характеристикам популяционно-генетических параметров сравнивают локальные популяции рыб в пределах обследованных территорий, отслеживают миграцию зараженных популяций рыб на определенных, ограничивающих данную миграцию территориях (Хомах), далее по сходству и различию популяционно-генетических параметров отслеживают возможные границы территорий популяции зараженной рыбы, т.е. природных очагов биогильментозов.

2. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что отлов особей производят в период движения рыбы на нерест.

3. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что отлов популяции рыбы производят в Обь-Иртышском речном бассейне.

4. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что для отлова популяции рыбы используют сетчатые орудия лова.

5. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что производят отлов рыбы породы карповых, в частности язя.

6. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что забор мышечной ткани отловленной особи популяции рыбы производят с помощью скальпеля и пинцета.

7. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что для вертикального электрофореза подготавливают полиакриламидный гель (ПААГ).

8. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что в исследуемых особях выявляют наличие гельминтов, в частности описторхоза.

9. Способ определения границ природных очагов биогельминтозов по п.1, отличающийся тем, что после определения возможных границ территории очага каждой зараженной популяции рыбы проводят противоэпидемиологические мероприятия среди населения.