СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕГИДРОАНАЛОГОВ СТЕРОИДОВ Российский патент 1995 года по МПК C07J5/00 C07J7/00 C12P33/02 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидропроизводных стероидных соединений с помощью бактериальных клеток, и может быть использовано в микробиологической, химической и фармацевтической отраслях промышленности.

Реакция 1-ен дегидрирования стероидов имеет большое практическое значение, так как введение двойной связи в кольцо А стероидной молекулы приводит к повышению активности стероидных соединений изучаемого ряда.

Так, хорошо известный лекарственный препарат преднизолон (1,2-дегидропроизводное гидрокортизона) применяют при ревматизме, инфекционном неспецифическом полиартрите, бронхиальной астме, острой лимфатической и мислоидной лейкоме, инфекционном мононуклеозе и других заболеваниях.

6α -метилпреднизолон (1,2-дегидропроизводное 6α -метилгидрокортизона) по сравнению с преднизолоном обладает более высокой противовоспалительной и противоаллергической активностью и оказывает меньше побочных действий, в частности не раздражает слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Препарат также применяется при заболеваниях ревматического характера, бронхиальной астме, сенной лихорадке, при переливании крови и в трансплантологии.

6α -метил преднизолон используется и в качестве субстрата для получения его производных, которые применяются как лекарственные препараты для местной обработки при различных кожных заболеваниях и ожогах, и для получения ингаляционных средств терапии различных аллергических заболеваний дыхательных путей.

Особенностью стероидных соединений является их низкая растворимость в воде, что осложняет их превращения. Как субстрат, так и продукт в течение реакции большей частью находятся в твердой фазе, в результате чего скорость реакции определяется скоростью растворения гетерогенных частиц субстрата и некоторыми диффузионными факторами. Благодаря низкой растворимости субстрат и продукт могут взаимодействовать друг с другом, образуя определенную кристаллическую структуру, что делает субстрат недоступным для дальнейшей трансформации [1]
Низкая степень превращения стероидного субстрата, а именно наличие примесей субстрата в конечном продукте, является серьезным препятствием для получения стероидных лекарственных препаратов, в том числе дегидроаналогов, отвечающих требованиям фармакопеи.

Для улучшения диспергирования стероидов-субстратов в воде применяют предварительное механическое разрушение, добиваясь при этом наиболее гомогенного распределения по размерам частиц [2] Однако этот прием не позволяет снизить в достаточной мере содержание субстрата в целевом продукте, которое, как правило, при дегидрировании составляет 16% Это требует дополнительной стадии очистки продукта, что приводит к потерям дорогостоящего преднизолона, достигающим 35%
Мелкодисперсную эмульсию стероидов в воде получают путем внесения их в виде раствора в органических растворителях, после чего растворители упаривают [3]
Иногда проводят реакцию в присутствии растворителя, смешивающегося с водой, например диметилсульфоксидом, который вносят не только одновременно с субстратом [4] но и последовательно [5] что также улучшает диспергирование субстрата. Применяют органические растворители наряду с солюбилизирующими агентами [5, 6] Однако органические растворители, как смешивающиеся, так и не смешивающиеся с водой, оказывают токсичное действие на микроорганизмы, а солюбилизирующие агенты приводят к образованию пены, что затрудняет массообмен и аэрирование системы. Как правило, при использовании органических растворителей реакцию проводят в присутствии искусственных акцепторов электронов, чаще всего менадиона [6] Однако даже при этом не достигается высокая степень превращения. Так, при получении преднизолона и 6 α-метилпреднизолона с помощью предварительно высушенных и прогретых клеток A.simplex (АТСС 6946) степень превращения составляет 91% даже при такой низкой исходной концентрации субстрата как 0,5-2,5 г/л [6]
Известен способ получения преднизолона из гидрокортизона иммобилизованными клетками Arthrobacter simplex, где в качестве солюбилизирующего агента вместо органических растворителей (метанол) используют блок-сополимер полидиметилсилоксан-полиэтиленгликоль [7] что позволяет эффективно проводить процесс дегидрирования (с высокой степенью превращения) при исходных концентрациях гидрокортизона около 0,3 г/л.

Однако не показано использование указанных полимеров в процессах трансформации с большими исходными концентрациями субстратов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения стероидных производных, например, предусматривающий микробиологическую трансформацию стероидных субстратов, в том числе дегидрирование некоторых кортикостероидных, в присутствии полимеров природного происхождения, интенсифицирующих процесс: α -, β или γ -циклодекстринов или их смесей и искусственного акцептора электронов менадиона [8] Способ позволяет за счет увеличения растворимости стероидов в 3-100 раз, уменьшения эффекта ингибирования продуктом повысить степень превращения.

Так, превращение гидрокортизона в преднизолон достигает 98% при исходной концентрации субстрата 4 г/л (в присутствии менадиона 10 г/л). Циклодекстрины, которые добавляют в реакционную смесь в начале или в течение реакции, могут быть регенерированы из реакционной смеси после окончания процесса со степенью регенерации циклодекстрина 58%
Основными недостатками указанного способа являются низкая эффективность процесса из-за недостаточно высокой исходной концентрации субстрата и необходимости добавления в реакционную смесь менадиона, токсичного и дорогостоящего реагента. Кроме того, присутствие гидрофобного менадиона в реакционной среде затрудняет очистку гидрофобного продукта.

Следует иметь в виду, что использование циклодекстринов, продуктов модификации и частичной деградации крахмала сопряжено с определенными трудностями, связанными с проблемами природных и пищевых ресурсов. Кроме того, ограниченная доступность, его высокая цена, подверженность действию микроорганизмов (что создает определенные трудности при хранении) доказывают необходимость поиска и создания новых синтетических полимеров, позволяющих с большей эффективностью проводить процессы трансформации стероидов.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности процесса микробиологической трансформации стероидных соединений и улучшение его экологических характеристик.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении способа, заключается в увеличении исходной концентрации субстрата при сохранении высокой степени превращения и увеличении выхода целевых продуктов, а также упрощении процесса.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в способе получения дегидроаналогов стероидов путем микробиологической трансформации Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии полимерного материала в качестве полимерного материала используют гомо- или сополимер N-винилкапролактама с молекулярной массой от 10⁴ до 10⁶, затем целевой продукт выделяют.

Полимеры класса N-винилкапролактама растворимы в воде, способны к комплексообразованию, обладают биосовместимостью и способностью к обратимому термоосаждению при повышенных температурах, что позволяет выделять продукт более простым способом.

Добавление в реакционную среду указанных полимеров позволяет повысить начальную концентрацию субстрата и проводить процессы трансформации с высокой степенью превращения без использования менадиона. Полимер может быть регенерирован со степенью регенерации 95% и повторно использован.

Целевой продукт может быть выделен из реакционной среды различными методами с использованием известных приемов, например с применением нагревания и экстракции органическими растворителями.

Использование: в биотехнологии, микробиологии и фармацевтике, в частности в способе получения дегидроаналогов стероидов, например гидрокартизона, 6 α -метилгидрокортизона. Сущность изобретения: способ предусматривает микробиологическую трансформацию в присутствии водорастворимого полимера - N-винилкапролактама (мол. м. 10000 1000000) с выделением целевого продукта при нагревании до 50 90°С культуральной жидкости и этилацетата (1 1 об). Скоагулированный полимер отделяют, жидкие фазы разделяют, этилацетат упаривают с последующей промывкой продукта органическим растворителем. Вместо N-винилкапролактама можно использовать его сополимеры с виниловым спиртом (содержание последнего в сополимере до 46%), или с винилацетатом (содержание до 45%), или с винилметилацетамидом (содержание до 15%). За счет применение гомо- и сополимеров N-винилкапролактама можно проводить трансформацию при повышенных концентрациях субстратов при упрощении процесса выделения продуктов, выход которых достигает 95% и высокой степени регенерации (95%) полимера. 3 з.п.ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕГИДРОАНАЛОГОВ СТЕРОИДОВ, включающий микробиологическую трансформацию соответствующих Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии полимерного материала с последующим выделением из реакционной среды целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют гомо или сополимер N винилкапролактама с мол. м. 10⁴ 10⁶. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют сополимер N-винилкапролактама с виниловым спиртом с содержанием последнего в сополимере до 46%
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют сополимер N-винилкапролактама с винилацетатом с содержанием последнего в сополимере до 45%
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют сополимер N-винилкапролактама с винилметилацетамидом с содержанием последнего в сополимере до 15%