СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА Российский патент 1995 года по МПК C12P33/00 C12P33/02 C12R1/06 C12P33/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидрированных производных стероидных соединений с помощью иммобилизованных клеток (ИмК) микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленности.

Дегидрированные стероидные соединения, например преднизолон, 6α -метилпреднизолон, обладают более высокой физиологической активностью по сравнению с исходными субстратами и широко используются в качестве эффективных лекарственных препаратов при заболеваниях ревматического характера, бронхиальной астмы, аллергических реакциях.

Известен способ получения преднизолона с помощью ИмК A.globiformis при проведении процесса 1,2-дегидрирования гидрокортизона в непрерывных условиях при вводе субстрата в реактор сверху или снизу.

При непрерывном потоке через реактор используют водные растворы гидрокортизона. Растворимость гидрокортизона составляет 0,28 г/л. Однако при работе в этом режиме из-за недостаточной аэрации не удается достичь полного превращения гидрокортизона, даже варьируя скорость нисходящего протока в пределах 5-300 мл/ч, при этом процент превращения субстрата остается постоянным 50-60% Снижение скорости протока гидрокортизона способствует протеканию побочных восстановительных процессов и накоплению в культуральной жидкости 20 β -восстановленных производных. Применение искусственных акцепторов электронов феназинметасульфата, менадиона и др. позволяет ингибировать протекание побочных процессов и интенсифицировать превращение гидрокортизона в преднизолон.

При проведении трансформации в колонке с восходящим потоком раствора гидрокортизона при перемешивании биокатализатора и продуве воздуха выход продукта увеличивается, а при низких скоростях протока субстрата (до 20 мл/ч) удается достичь полного превращения растворенного гидрокортизона (0,2 г/л) в преднизолон.

При сохранении этого режима трансформации, но при увеличении нагрузки субстрата до 0,5-1,0 г/л и применении его в виде кристаллов наблюдается их вынос из реакционной зоны и накопление в виде пены в верхней части реактора. Наблюдается также оседание кристаллов субстрата на стенках шлангов перистальтических насосов.

Эти факторы вызывают нарушение баланса стероидных соединений в реакционной зоне, резко снижают выход продукта, затрудняют анализ за ходом ферментативного процесса и создают ряд других технологических трудностей.

Таким образом, общим недостатком известных непрерывных способов получения преднизолона является их малая эффективность, обусловленная неполным превращением гидрокортизона в преднизолон, необходимостью использования гидрокортизона в низкой концентрации, малой скоростью восходящего протока растворенного субстрата, при которой достигается его полное превращение образованием побочных продуктов, в частности, 20β -восстановленных производных, потерей субстрата за счет его оседания в шлангах (коммуникациях).

Недостатком рассматриваемых способов получения преднизолона является также использование больших объемов органических растворителей для экстракции продукта из водной фазы. Извлечение продукта проводится двукратной экстракцией двойным объемом органического растворителя. В результате на 1 л реакционной среды, содержащей 0,1-1,0 г/л продукта, требуется 4 л органического растворителя: хлороформа или этилацетата.

Известен способ получения преднизолона в непрерывных условиях, заключающийся в том, что готовят суспензию гидрокортизона (0,3-1,0 г/л) в фосфатном буфере, которую непрерывно подают в реактор, заполненный иммобилизованными в гранулы полиакриламидного геля клетками Arthorbacter globiformis. Раствор, получаемый на выходе из реактора, содержащий продукт преднизолон, охлаждают в холодильной камере с целью осаждения продукта в виде кристаллов. Выпавшие кристаллы преднизолона по мере их накопления отделяют на фильтре, а жидкую фазу непрерывно возвращают в емкость с суспендированным гидрокортизоном. Степень превращения гидрокортизона в преднизолон составляет 95% (данные ТСХ). Способ позволяет осуществлять выделение продукта без использования органических растворителей и сложного технологического оборудования и обеспечивает возможность создания экологически чистого производства.

Основной недостаток данного способа низкая производительность, обусловленная: проскоком субстрата из реактора, в котором происходит турбулентное перемешивание и флотация кристаллов, и попадание его вместе с продуктом в холодильную камеру. Отделение гидрокортизона в процессе очистки продукта преднизолона обуславливает резкое снижение его выхода; деструкцией продукта процессов при низких скоростях протока и низкой (< 0,5 г/л) концентрации субстрата, обусловленной возвращением раствора, полученного после отделения кристаллов продукта, в емкость с суспендированным субстратом; активацией побочного процесса 1,2-гидрирования преднизолона в условиях отсутствия аэрации во влажной массе кристаллов продукта, накапливаемых на фильтре, обусловленной десорбцией клеток микроорганизмов из носителя, вымыванием их из реактора и накоплением их вместе с продуктом. Сохранение этими микроорганизмами стероид-1,2-гидрогеназной активности, определяет увеличение остаточного гидрокортизона в осадке продукта по сравнению с жидкой фазой реактора на 7-10% В результате суммарное содержание остаточного гидрокортизона в осадке кристаллов продукта, составляет 12-15% Очистка продукта от остаточного гидрокортизона сопровождается значительной потерей самого продукта (15-20%).

Перечисленные факторы исключают возможность и целесообразность масштабирования установки.

Известен способ получения преднизолона в периодических условиях, основанный на трансформации кристаллического гидрокортизона в концентрации 5-10 г/л свободными и ИмК A. globiformis со степенью превращения 85% Однако после очистки преднизолона от остаточного гидрокортизона его выход, считая на исходный гидрокортизон, составляет 59,36%
Известен способ получения преднизолона, согласно которому трансформацию кристаллического гидрокортизона (5-10 г/л) свободными и ИмК A. globiformis осуществляют в присутствии β -циклодекстрина. В этом случае степень превращения гидрокортизона в преднизолон составляет 95-97%
Основной недостаток способа потери продукта при его отделении от β -циклодекстрина. Кроме того, реализация способа затруднена из-за отсутствия производства отечественного β -циклодекстрина.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения преднизолона с помощью свободных и ИмК A. globiformis, предусматривающий приготовление суспензии гидрокортизона (1,0 г/л) в фосфатном буфере, трансформацию гидрокортизона ИмК Arthrobacter globiformis 193, отделение суспензии, содержащей продукт, от гранул геля с иммобилизованными в них клетками, подкисление суспензии до рН 5,0 с целью ингибирования активности ферментов, катализирующих побочные реакции, и выделение преднизолона из нее экстракцией органическими растворителями с последующим упариванием экстрактов в вакууме до сухого остатка и перекристаллизацию полученного продукта.

Длительность процесса трансформации при весовом соотношении клетки субстрат 2:1 составляет 2,0-2,5 ч. Степень превращения субстрата при проведении первых 5-8 трансформаций составляет 95-98% В последующий период при проведении последовательных трансформаций происходит постепенное повышение содержания остаточного гидрокортизона, что определяет необходимость увеличения продолжительности процесса.

Недостатки данного способа сложность и трудоемкость процесса и высокая степень экологической опасности, связанные с применением на стадии выделения и очистки продукта больших количеств органических растворителей.

Цель изобретения создание эффективного способа получения преднизолона, обеспечение условий для экологически чистого процесса и повышения его экономичности.

Цель может быть достигнута упрощением способа, снижением трудоемкости процесса, улучшением условий труда, обеспечением экологической безопасности, повышением его экономичности.

Сущность изобретения заключается в том, что приготавливают суспензию гидрокортизона в фосфатном буфере, трансформацию его иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193, отделение суспензии, содержащей продукт, кратковременное прогревание ее при 80-95^оС до растворения кристаллов, охлаждение полученного раствора в холодильной камере для образования кристаллов продукта с последующим их отделением от жидкой фазы, которую используют для приготовления суспензии гидрокортизона в последующих операциях вместо буферного раствора.

Использование приема кратковременного прогревания суспензии, содержащей продукт, при температуре 80-95^оС, позволяет, с одной стороны, подавить протекание побочных реакций путем ингибирования ферментативной активности микроорганизмов, десорбированных из носителя в процессе трансформации и вымытых из реактора, а с другой провести одновременно процесс перекристаллизации продукта и снизить потери продукта и упростить процесс, обеспечить экологическую безопасность производства за счет отсутствия в технологическом процессе органических растворителей, а также повысить его экономичность.

Способ позволяет осуществлять все операции, начиная со слива суспензии, содержащей продукт, в непрерывном режиме, совмещая их во времени между собой и с осуществлением трансформации следующей порции субстрата, что в совокупности с возвратом жидкой фазы на стадию приготовления суспензии субстрата обеспечивает цикличность процесса и создает предпосылки его автоматизации.

П р и м е р 1. Выращивание A. globiformis, иммобилизация. Культуру A. globiformis 193 выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, на кукурузно-глюкозной среде (глюкоза 1% кукурузный экстракт 1%) в присутствии ацетата кортизона (20 мг%) индуктора 3-кетостероид-1-ендегидрогеназы. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре 28^оС, 220 об/мин. Клетки отделяют от среды центрифугированием (при 5000 g), отмывают 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2 и готовят суспензию клеток, 100 мг (сухой вес) в 1 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2.

Включают клетки в 10%-ный полиакриламидный гель с 0,5%-ным содержанием сшивающего агента при температуре 4^оС. Полимеризационную смесь тщательно перемешивают и после 2 мин выдерживания в момент начала гелеобразования переносят в камеру холодильника на 10 мин до завершения процесса полимеризации.

Образовавшийся блок геля с включенными клетками фрагментируют, продавливая через сито. Полученные гранулы (1,0-1,2 мкм) промывают стерильной водопроводной водой декантацией 5-8 раз и используют в качестве биокатализатора процесса превращения гидрокортизона в преднизолон.

На чертеже показана схема установки для получения преднизолона.

Установка включает емкость 1 исходного субстрата, ферментер 2, емкость 3 для сбора суспензии, содержащей продукт, термостат 4, холодильную камеру 5, фильтр 6, сборник 7 фильтрата.

В биореактор 1 (V 10 л) вводят 6,7 л 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащего субстрат в концентрации 1,0 г/л и гранулы геля с включенными клетками объемом 1300 мл. Соотношение объема гранул к объему суспензии гидрокортизона составляет 1:5. Весовое соотношение клеток A. globiformis (вес сухого вещества) к гидрокортизону составляет 2:1. Процесс трансформации осуществляют при 28^оС.

Анализ продуктов трансформации в ходе процесса проводят методом тонкослойной хроматографии на пластинках силуфол UV-254. Разделение продуктов осуществляют в системе бензол-ацетон 3:1 (об/об).

Трансформацию проводят 2,0-2,5 ч. При завершении процесса степень превращения гидрокортизона в преднизолон составляет 97-98% После окончания процесса трансформации суспензию, содержащую стероиды, из биореактора через сетчатый фильтр сливают в промежуточную емкость, из которой подают в термостат для кратковременного прогревания при 80-95^оС. Прогревание заканчивают, когда при визуальной оценке раствор становится прозрачным, что свидетельствует о растворении кристаллов продукта. Полученный раствор через фильтр, который служит для отделения мелких частиц геля, направляют в холодильную камеру, где при охлаждении формируются кристаллы преднизолона. Кристаллы отделяют фильтрацией. Оставшийся фильтрат, содержащий 0,15-0,2 г/л растворенного преднизолона, используют для приготовления суспензии субстрата гидрокортизона.

Выход продукта при 1-й и 2-й трансформации составляет 65-70% от использованного субстрата (0,65-0,7 г/л).

П р и м е р 2. Способ осуществляют, как в примере 1, но готовят суспензию гидрокортизона с концентрацией 0,8 г/л, используя вместо буфера фильтрат, полученный после отделения кристаллов продукта с первого процесса трансфоpмации. Суммарная концентрация стероидов в реакторе составляет 1,0-1,2 г/л за счет наличия в фильтрате растворенного преднизолона (0,15-0,2 г/л) и адсорбированного преднизолона на стенках реактора и гранулах геля. Трансформацию проводят 2,0-2,5 ч. При завершении процесса степень превращения гидрокортизона составляет 97-98% выход продукта от субстрата 80-85% (0,64-0,68 г/л). В указанных условиях возможно проведение до 50 повторных трансформаций.

П р и м е р 3. Способ осуществляют, как в примере 1, но готовят суспензию гидрокортизона с концентрацией 0,6 г/л, используя фильтрат, характеристика которого представлена в примере 2. Суммарная концентрация стероидов в реакторе не превышает 1,0 г/л. Трансформацию проводят 2,0-2,5 ч. При завершении процесса степень превращения составляет 97-98% выход продукта от субстрата 80-85% (4,8-5,1 г/л). Возможно проведение 50 повторных трансформаций.

Предлагаемый способ позволяет осуществить эффективный, простой, экологически чистый и достаточно экономичный процесс получения преднизолона, который легко поддается масштабированию, может быть автоматизирован и осуществлен в промышленных условиях.

Использование: в биотехнологии, медицинской промышленности. Сущность изобретения: готовят суспензию гидрокортизона в фосфатном буфере, проводят трансформацию его иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193. По окончании трансформации отделяют суспензию, содержащую продукт, и подвергают ее кратковременному прогреву при 80 95°С до растворения кристаллов продукта. Полученный раствор охлаждают. Образовавшиеся кристаллы отделяют от жидкой фазы, которую используют для приготовления суспензии гидрокортизона в последующих операциях вместо буферного раствора. 1 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА, предусматривающий приготовление суспензии гидрокортизона в фосфатном буфере, трансформацию его иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193, отделение суспензии, содержащей целевой продукт, и его выделение с последующей кристаллизацией, отличающийся тем, что для выделения преднизолона суспензию, содержащую целевой продукт, подвергают кратковременному прогреванию при 80-95^oС до растворения кристаллов, затем полученный раствор охлаждают для образования кристаллов, при этом жидкую фазу после отделения кристаллов используют для приготовления суспензии гидрокортизона в последующих операциях вместо буферного раствора.