СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1,2-ДЕГИДРОПРОИЗВОДНЫХ 4-ДЕЛЬТА-3-КЕТОСТЕРОИДОВ Российский патент 2000 года по МПК C12P33/00 C12P33/02 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/06 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидропроизводных стероидных соединений с помощью клеток микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленностях.

Дегидропроизводные кортикостероидные соединения, например преднизон, преднизолон, 6α-метилпреднизолон, обладают более высокой физиологической активностью по сравнению с исходными субстратами, такими как кортизон, гидрокортизон, 6α-метилгидрокортизон, и широко используются в качестве эффективных лекарственных препаратов при раковых заболеваниях, заболеваниях ревматического характера, бронхиальной астмы, аллергических реакциях. Другие дегидропроизводные, например андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД), 1,2-дегидрокортексолон могут быть использованы в качестве полупродуктов для синтеза других стероидных соединений-эстрогенов и кортикостероидов ряда прегнана [1, 2].

В качестве биокатализаторов процесса 1,2-дегидрирования используют культуры родов: Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces и др. [3].

Основной проблемой промышленного получения 1,2-дегидрированных кортикостероидов путем микробиологической трансформации является малая эффективность процесса, обусловленная необходимостью использования субстрата в низких концентрациях для достижения его полного превращения в конечный продукт.

Известен способ получения преднизолона в непрерывном режиме при вводе растворенного субстрата в реактор с иммобилизованными клетками сверху или снизу [4, 5].

При непрерывном потоке (от 5 до 300 мл/мин) растворенного гидрокортизона (0,4 г/л) через реактор с иммобилизованными в полиакриламидный гель (ПААГ) клетками Arthrobacter globiformis 193 из-за недостаточной аэрации степень превращения субстрата не превышает 50-60%.

При проведении трансформации с восходящим потоком субстрата (до 20 мл/ч) и при продуве воздуха, т.е. при имитации условий периодического культивирования, отмечена полная конверсия растворенного гидрокортизона в преднизолон.

Недостатком данного способа получения преднизолона является его малая производительность, обусловленная низкой концентрацией растворенного субстрата и низкими скоростями его протока. Осуществление этого способа требует специального технологического оборудования, осложняет масштабирование. Совокупность указанных признаков фактически исключает практическую реализацию данного способа.

В литературе описан способ получения преднизолона при трансформации растворенного гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193 в периодических условиях культивирования [6]. В соответствии с этим способом достигается полное превращение растворенного (0,4 г/л) гидрокортизона в преднизолон. Основным недостатком данного способа является малая производительность процесса из-за невозможности полного превращения субстрата при более высоких исходных концентрациях субстрата. В связи с этим способ не имеет практической значимости.

С целью повышения эффективности процесса получения преднизолона субстрат вносят в реакционную среду в виде кристаллов или микрокристаллов. В этом случае в процессе микробиологической трансформации субстрат и образующийся продукт находятся фактически в твердой фазе. Процесс микробиологической трансформации протекает по схеме, предложенной Кондо и Масуо [7].

Гидрокортизон (кристаллы) ⇐⇒ Гидрокортизон (раствор) ⇒ Преднизолон (раствор) ⇐⇒ Преднизолон (кристаллы)
При исходной нагрузке субстрата 1-50 г/л содержание остаточного гидрокортизона в конечном продукте возрастает от 2 до 20%. Необходима очистка получаемого технического преднизолона от остаточного гидрокортизона, содержание которого наряду с другими побочными продуктами по данным Российской Фармакопеи 42-2780-91 не должно превышать 3%.

Известен способ получения преднизолона в непрерывных условиях, заключающийся в непрерывной подаче суспензии микрокристаллического гидрокортизона (0,3-1,0 г/л) в фосфатном буфере в реактор, в котором происходит турбулентное перемешивание иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Arthrobacter globiformis 193, субстрата и образующегося преднизолона [8]. Получаемый продукт на выходе из реактора, содержащий 95% преднизолона и 5% гидрокортизона, охлаждают в холодильной камере с целью осаждения продукта в виде кристаллов, а жидкую фазу непрерывно возвращают в емкость с суспендированным гидрокортизоном.

Основной недостаток данного способа заключается в проскоке из реактора субстрата и десорбированных из носителя клеток микроорганизмов и попадание их в холодильную камеру, где во влажной массе накапливающихся кристаллов продукта в отсутствие аэрации активируется 1,2-гидрогеназная активность клеток, определяющая превращение преднизолона в гидрокортизон. В результате суммарное содержание остаточного гидрокортизона в осадке кристаллов продукта увеличивается на 7-10% и достигает 12-15%. Высокое содержание остаточного гидрокортизона в продукте, определяющее значительные (до 30%) потери преднизолона в процессе его очистки, а также низкая концентрация субстрата, характеризуют данный способ получения преднизолона как малоэффективный, не имеющий практической значимости.

Указанный основной недостаток рассмотренного способа получения преднизолона устраняется при другом способе получения преднизолона, также с использованием иммобилизованных в ПААГ клеток A. globiformis 193 [9]. В соответствии с этим способом трансформацию гидрокортизона в концентрации от 0,6 до 1,2 г/л осуществляют в реакторе периодического действия. После завершения процесса степень превращения субстрата в продукт составляет 97-98%. Получаемую суспензию или раствор продукта при выходе из реактора кратковременно прогревают до 80-95^oC с целью инактивации ферментативной активности клеток, десорбированных из носителя, и подают в холодильную камеру для образования и накопления кристаллов продукта.

Способ позволяет осуществлять все операции, начиная со слива суспензии продукта, в непрерывном режиме, совмещая их во времени. Получаемый продукт без дополнительной очистки по содержанию остаточного гидрокортизона соответствует требованиям Фармакопеи.

Недостатком данного способа является малая эффективность, обусловленная необходимостью использования субстрата в концентрации, не превышающей 1,2 г/л. При увеличении нагрузки субстрата получаемый продукт по содержанию остаточного гидрокортизона не отвечает требованиям Фармакопеи.

Известен способ получения преднизолона с помощью иммобилизованных в ПААГ клеток Arthrobacter globiformis 193 при нагрузке микрокристаллического гидрокортизона 5,0 г/л [10]. Способ осуществляют в реакторе промышленного типа специальной конструкции с коэффициентом заполнения 0,8. При соотношении клетки (сухой вес)/субстрат (вес/вес) = 5:1 и при длительности процесса 7-8 ч выход преднизолона на стадии микробиологической трансформации составляет 88-90% и при продолжении процесса не увеличивается, содержание остаточного гидрокортизона 10-12%. Выход преднизолона, соответствующего по качеству требованиям Фармакопеи, не превышает 56%.

Способ позволяет осуществлять превращение гидрокортизона при его повышенной нагрузке и эффективном использовании технологического оборудования. Специальная конструкция реактора, обеспечивающая интенсивный массообмен, позволяет снизить на 3-5% содержание остаточного гидрокортизона в получаемом продукте.

Основным недостатком данного способа является высокое содержание остаточного гидрокортизона, что определяет значительные потери преднизолона на стадии химической очистки.

Описан способ получения преднизолона в периодических условиях с помощью клеток Arthrobacter simplex АТСС 6946 [11]. В соответствии с этим способом содержание в среде субстрата - микронизированного гидрокортизона составляет 20,0 г/л. Для достижения степени превращения 95% используют искусственный акцептор электронов - менадион (0,25-0,3 мг/г гидрокортизона) и поверхностно-активное вещество - сахарозопальмитат-стеарат (0,1 г/л). Процесс трансформации проводят в ферментере с рабочим объемом 100 л в водной среде в присутствии глюкозы (1,25 г/л) в течение 16-18 ч. В результате из 2,0 кг гидрокортизона получают 1,415 кг технического преднизолона (70,75% от исходного количества субстрата) с 95% содержанием продукта. Остаточный гидрокортизон в продукте составляет 5%.

Получаемый продукт требует дальнейшей очистки от остаточного гидрокортизона, что повлечет дальнейшее снижение его выхода. Для осуществления данного способа необходимо использование глюкозы, ПАВ, искусственного акцептора электронов, что снижает экономическую эффективность технологии. Применение детергентов приводит к интенсивному пенообразованию, что обусловливает необходимость специальных методов для его устранения или предотвращения.

В литературе представлены и обсуждаются несколько точек зрения относительно причин неполного превращения гидрокортизона в преднизолон:
1) стерические ограничения доступа субстрата в клетки микроорганизмов, создаваемые кристаллами образующегося продукта-преднизолона [1]; 2) сокристаллизация гидрокортизона с преднизолоном и образование смешанных кристаллов [12] ; 3) восстановление преднизолона, приводящая к образованию гидрокортизона из преднизолона [13].

С целью устранения возможной сокристаллизации субстрата и продукта используют органические растворители, смешивающиеся и несмешивающиеся с водой [14].

Токсичность органических растворителей (этанола, метанола, диметилсульфоксида, диметилформамида, наиболее часто используемых для растворения стероидных субстратов) по отношению к микроорганизмам и их ингибирующее воздействие на ферментативую активность ограничивают их применение в процессах микробиологической трансформации областью низких концентраций субстрата. Такой подход в настоящее время не имеет практической значимости.

В двухфазных системах на основе несмешивающихся с водой органических растворителей при распределении микроорганизмов в водной фазе, а гидрофобных субстратов в органической фазе возможно снижение токсичного воздействия органических растворителей, с одной стороны, и, с другой стороны, увеличение растворимости субстрата и продукта [15].

Известен способ получения 1,2-дегидропроизводных ряда прегнана в двухфазной системе, представленной 50% (об/об) фосфатным буфером, pH 7,0 и 50% (об/об) n-октанолом, или хлороформом, или толуолом, используя клетки Arthrobacter simplex АТСС 6946 [16]. При концентрации 21-ацетата-6α-метигидрокортизона 4,5 г/л выход 1,2-дегидрированного продукта составил 90%. Добавление в систему ПАВ ускоряло скорость реакции, но не приводило к увеличению выхода продукта.

Недостатками рассматриваемого способа получения 1,2-дегидрированного производного гидрокортизона является высокое содержание остаточного субстрата, а также необходимость использования больших объемов органических растворителей, что повышает степень экологической опасности, пожароопасности и производства. Указанные недостатки, а также необходимость применения специального оборудования, ограничивают возможность масштабирования процесса и его промышленную реализацию.

Известен способ получения 1,2-дегидрированного 21 ацетата 16 метил - вещества "S" Рейхштейна в микроэмульсионной двухфазной системе с использованием клеток Arthrobacter simplex АТСС 6946 [17]. Микроэмульсионная система содержит органическую фазу, представленную производными бензола или фосфолипидами (75-95%, об/об) со стероидом (1-60 г/л) и водную фазу (5-25%, об/об) с клетками микроорганизмов (5-30 г/л). Процесс осуществляют в присутствии неионогенных ПАВ и акцептора электронов - менадиона. В указанных условиях за 14-16 ч достигают 98% превращения субстрата.

К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести использование органических растворителей и, следовательно, пожароопасность производства, многокомпонентность системы и, следовательно, экономическую нецелесообразность, технологические трудности осуществления метода, необходимость использования специального оборудования.

Альтернативным подходом снижения сокристаллизации субстрата с продуктом и уменьшения остаточного субстрата в продукте является использование синтетических полимеров и сополимеров, например полидиметилсилоксана с полиэтиленгликолем [18]. Синтетические полимеры, благодаря способности их гидрофобных циклов образовывать комплексы с гидрокортизоном и другими кортикостероидами, являются солюбилизирующими агентами и способствуют повышению эффективности процессов трансформации.

Известен способ получения преднизолона, 6α-метилпреднизолона с помощью клеток Arthrobacter globiformis 193 в присутствии синтетических полимеров, таких как гомо- и сополимеры N-винилкапролактама [19]. В присутствии 2%-ного поливинилкапролактама (ПВК) с мол.м. 900 тыс. трансформацию гидрокортизона в концентрации 7,0 г/л осуществляют за 6-8 ч. Выход преднизолона составляет 98%. Содержание остаточного гидрокортизона не превышает 1%. Превращение 6α-метилгидрокортизона в концентрации 5,0 г/л завершают за 24 часа. Содержание в культуральной жидкости 1,2-дегидрированного продукта по данным метода ТСХ составляет - 97%, нетрансформированного субстрата - 2%. При повышении концентрации ПВК до 5% выход продукта снижается до 96%. При использовании сополимера (1%) винилкапролактама (ВК) с виниловым спиртом (ВС) в процентном соотношении 72:28 степень превращения 6α-метилгидрокортизона в 6α-метилпреднизолон составляет 99%. Длительность процесса - 8 ч. 1,2-Дегидрирование 21 ацетата 6α-метилгидрокортизона (5,0 г/л) в присутствии ПВК (1%) протекает значительно более медленно и заканчивается за 140 ч. По данным ТСХ после завершения процесса в культуральной среде содержится 90% 6α-метилпреднизолона, 5% исходного субстрата и 2% 20β-оксипроизводного 6α-метилпреднизолона.

Среди недостатков рассматриваемого способа получения 1,2-дегидропроизводных 3-кетостероидов в присутствии гомо- и сополимеров N-поливинилкапролактама следует отметить недостаточно высокую концентрацию субстратов: гидрокортизона - до 7,0 г/л, 6α-метилпреднизолона - до 12,5 г/л, 21-ацетат-6α-метилгидрокортизона - до 5,0 г/л, что не позволяет значительно повысить производительность процесса. Технологичность метода ограничена высокой степенью пенообразования, а также снижением эффективности массообмена вследствие высокой вязкости среды в присутствии полимеров. Существенным недостатком данного способа является отсутствие в России промышленного производства синтетических полимеров.

Известны подходы проведения процессов микробиологической трансформации стероидных соединений, основанные на использовании α,-β- и γ-циклодекстринов (ЦД) [20]. Указанные циклодестрины, представляющие собой циклические структуры, состоящие соответственно из 6, 7, 8 остатков глюкозы, способны образовывать комплексы включения с субстратами и продуктами. Образование комплексов может сопровождаться изменением свойств исходного соединения: химической стабильности, увеличением смачиваемости, снижением токсичности и др.

В литературе описан способ получения преднизолона, согласно которому трансформацию гидрокортизона (4,0 г/л) свободными отмытыми клетками Arthrobacter simplex АТСС 6946 осуществляют в ферментере с рабочим объемом 100 л в присутствии β-циклодекстрина (12,0 г/л) и искусственного акцептора электронов-менадиона (0,01 г/л) [21] . Субстрат вносят растворенным в метаноле (конечная концентрация - 4%), содержащем 0,4 г/л хлористого кальция. В указанных условиях достигается растворение субстрата и продукта, что исключает риск образования смешанных кристаллов. В результате из 400 г гидрокортизона получают 375 г преднизолона, содержащего остаточный гидрокортизон - 1,2%. Выход преднизолона составляет 93,75%.

Недостатком описываемого способа получения преднизолона является относительно низкая концентрация растворенного гидрокортизона, определяющая малую эффективность процесса. Использование менадиона и метанола в сочетании с низкими нагрузками субстрата в значительной степени снижает экономическую целесообразность и степень экологической безопасности.

Описан способ получения преднизолона клетками Arthrobacter simplex АТСС 6946 в присутствии α-ЦД [21] α-ЦД в концентрации 20,0 г/л вносят в 20-кратно разбавленную культуральную жидкость с растущей культурой и добавляют гидрокортизон (2,0 г/л), растворенный в метаноле (конечная концентрация - 2%), содержащий 10% по весу хлористого кальция. Процесс проводят в течение 5 ч, в отсутствие альфа-ЦД - за 8 ч. Получают из 2 г гидрокортизона 1,92 г (96%) преднизолона, 8,0 мг/л (0,4%) гидрокортизона и 40 мг (2%) 20β-восстановленного преднизолона.

Практическая значимость способа в значительной степени ограничена использованием 20,0 г/л концентраций α-ЦД - одного из наиболее дорогостоящих ЦД, низкой концентрацией субстрата, необходимостью применения метанола и содержанием в конечном продукте примесных соединений.

В литературе описан способ получения преднизолона из гидрокортизона отмытыми клетками Corynebacterium simplex [22]. Гидрокортизон, растворенный в метаноле, вносят в предварительно приготовленный раствор β-ЦД, содержащий клетки микроорганизмов. При содержании гидрокортизона в среде 2,0 г/л и в присутствии β-ЦД в концентрации 6,33 г/л и 12,66 г/л выход преднизолона через 3,5 часа трансформации в обоих вариантах составляет 1,3 г/л (65%). Содержание гидрокортизона 4,5 и 9,0% соответственно, т.е. с увеличением концентрации β-ЦД возрастает в 2 раза количество нетрансформированного гидрокортизона. При дальнейшем повышении концентрации β-ЦД в среде до 18,99 г/л резко снижается скорость реакции 1,2-дегидрирования, увеличивается количество нетрансформированного гидрокортизона и резко нарушается баланс стероидов. После 3,5 ч трансформации в среде накапливается лишь 0,63 г/л (32,5%) преднизолона. Содержание гидрокортизона составляет 0,23 г/л (11,5%). Сумма стероидов: гидрокортизона и преднизолона соответствует 43%, в тоже время в отсутствие β-ЦД - 83%. Причиной снижения скорости реакции, выхода преднизолона, увеличения содержания гидрокортизона в продукте и нарушения баланса стероидов является образование нерастворимых гидрокортизон-β-ЦД комплексов, в результате гидрокортизон выводится из зоны реакции. Образование комплекса наблюдалось при концентрации β-ЦД 18,99 г/л, превышающей его растворимость (15,0 г/л). Образование гидрокортизон-β-ЦД нерастворимых комплексов авторы отмечают также при внесении в раствор β-ЦД (15 г/л) гидрокортизона в концентрации выше 7,0 г/л.

По данным других авторов предельно возможная растворимость гидрокортизона в растворе β-ЦД составляет 4,5 г/л [20].

Недостатком рассматриваемых способов получения преднизолона с использованием β-ЦД является их низкая эффективность, обусловленная низкой растворимостью β-ЦД и комплексов гидрокортизон-β-ЦД. Применение метанола также ограничивает практическую реализацию этих способов.

Наиболее близким к предлагаемому по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов, относящихся к 4-дельта-3-кетостероидам, путем трансформации кортикостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии β-ЦД и снимающих трансмембранный потенциал клеток веществ, обеспечивающих полноту превращения гидрокортизона в преднизолон и подавление обратной реакции - реакции 1,2-гидрирования [23]. В качестве таких веществ используют аминокислоты: глицин, оксипролин, глутаминовую кислоту; кетокислоту -α-кетоглутаровую; а также никотинамид, ацетат ретинола и др. Процесс проводят при исходной концентрации гидрокортизона 5,0 и 10,0 г/л, весовом соотношении субстрат: клетки (сухой вес) 6,25:1 и 2,77:1, и при концентрации бета-ЦД 15,0 и 60,0 г/л соответственно. При трансформации гидрокортизона в концентрации 5,0 г/л выход преднизолона составляет 98-99%. Содержание остаточного гидрокортизона - 1,0-1,5%. Длительность процесса - 4 - 6 ч в зависимости от используемого вещества, снимающего трансмембранный потенциал клетки. При трансформации гидрокортизона иммобилизованными клетками достигают выход преднизолона 96,5%. Содержание остаточного гидрокортизона и 20β-восстановленного производного преднизолона составляет 1,5% и не более 2% соответственно. Расчеты показывают, что производительность процесса составляет 0,82-1,23 г•л^-1•ч^-1.

Трансформацию гидрокортизона в концентрации 10,0 г/л завершают за 3 часа и достигают выхода преднизолона 97-99%. Содержание остаточного гидрокортизона и 20β-восстановленного производного преднизолона не превышает 2 и 1% соответственно. Сокращение времени трансформации до 3 ч обусловлено увеличением количества клеток микроорганизмов более чем в 2 раза по сравнению с их содержанием при трансформации гидрокортизона в концентрации 5,0 г/л. Производительность процесса - 3,31 г•л^-1•ч^-1. Указанный эффект достигается в условиях сохранения гетерофазности среды вследствие ограниченной растворимости β-ЦД и его комплексов с субстратами и продуктами реакции, поскольку известно, что растворимость β-ЦД в водных растворах не превышает 15,0 г/л, в этих же пределах находится растворимость его комплексов с рассматриваемыми стероидами.

Основной недостаток рассматриваемого способа - невозможность для повышения производительности процесса увеличивать концентрацию субстрата из-за ограниченной растворимости β-ЦД и образующихся гидрокортизон-β-ЦД комплексов, что по данным литературы приводит к снижению скорости реакции, выхода преднизолона, нарушению балланса стероидов [20, 21]. Необходимость достижения массообменных характеристик, достаточных для обеспечения высокой скорости реакции в условиях гетерофазности снижает технологичность способа. Кроме того, использование соединений, снижающих величину трансмембранного потенциала клеток микроорганизмов и устраняющих протекание побочной восстановительной реакции, усложняет и удоражает технологию процесса.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании эффективного способа получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов, обеспечивающего высокий выход продукта при высоких нагрузках субстрата и высокой степени селективности процесса, а также отсутствие остаточного субстрата в продукте.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении этого изобретения, заключается в повышении производительности процесса за счет значительного увеличения нагрузки субстрата при полном его превращении в продукт.

Сущность способа заключается в том, что согласно способу получения 1,2-дегидропроизводных путем микробиологической трансформации 4-дельта-3-кетостероидов с помощью Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные β-циклодекстрина.

В качестве производных β-циклодекстрина могут быть использованы оксипропилциклодекстрин (ОПЦД), метилциклодекстрин (метилЦД) и др. Использование модифицированных ЦД обеспечивает перевод 3-кетостероидов в растворимую форму и проведение процесса в водной фазе процесса даже при высоких (свыше 20,0 г/л) нагрузках субстрата исключает феномен твердофазной ферментации или псевдокристаллотрансформации, возможность образования смешанных кристаллов, что позволяет значительно увеличить производительность процесса при полном превращении субстрата в продукт. Способ не требует использования для достижения полного превращения субстрата дополнительных добавок (в виде искусственных акцепторов электронов или соединений, снижающих трансмембранный потенциал клеток).

В литературе отсутствуют сведения об использовании модифицированных β-ЦД в процессах 1,2-дегидрирования стероидных соединений, и о возможном влиянии их на полноту превращения субстрата в продукт, соотношение скоростей прямой и обратной реакций, образование побочных продуктов. Описано использование химически модифицированных производных β-ЦД в процессах трансформации стеринов растительного и животного происхождения (ситостерина, холестерина) до стероидов андостанового ряда с помощью микроорганизмов рода Mycobacterium [24] . Однако в этих процессах интенсификация деградации боковой цепи стеринов обусловлена, главным образом, не использованием субстрата в растворимой форме, а образованием комплексов конечных продуктов с производным β-ЦД и устранением вследствие этого эффекта ингибирования процесса и/или деструкции образующихся продуктов. Основная масса субстрата при этом находится в твердом, нерастворимом состоянии.

Анализ продуктов трансформации в динамике процесса проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 10-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидных соединений при интенсивном перемешивании в течение 3 мин при нагревании до 40^oC. Аликвоты экстракта, содержащие 5 или 50 мкг вещества наносят на пластинку Силуфол UV 254 (15 х 15 см). Разделение стероидных соединений проводят в системе органических растворителей - бензол:ацетон (об/об) = 3:1. Оценку содержания стероидов проводят путем сравнения хроматографической подвижности (Rf), площади пятна и интенсивности поглощения в ультрахемископе "(Desaga") с образцами стандарта.

Определение содержания продуктов в момент завершения процесса трансформации осуществляют методом ВЭЖХ с использованием оборудования фирм Хьюлетт-Паккард (США) и Фармация-LKB (Швеция), на колонке типа C18 (5 мкм, 3 х 250 мм) в системе ацетонитрил: вода (40:60 об/об) при скорости протока 1 мл/мин, температуре 20^oC; детекция - по поглощению при 240 нм.

В качестве субстрата используют микронизированный гидрокортизон 98% чистоты фирмы "Russel Uclaf" (Франция), вещество "S" Рейхштейна 97% чистоты, полученное с завода "Акрихин" (Россия), анростендион (АД) 98% чистоты.

Выход продукта выражают в % от загруженного субстрата или в % от теоретически возможного выхода. Эти величины фактически совпадают, поскольку различие в молекулярной массе субстратов и продуктов составляет 2 единицы.

Полученные предлагаемым способом 1,2-дегидрированные 4-дельта-3-кетостероиды могут быть выделены любым из известных методов, предусматривающих экстракцию продуктов органическим растворителем (наиболее часто используется этилацетат), отгонку растворителя и последующую кристаллизацию конечного продукта.

Способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Бактерии Arthrobacter globiformis 193 культивируют на среде следующего состава, (г/л): кукурузный экстракт - 10,0; глюкоза - 10,0, водопроводная вода, pH 7,0-7,2, в присутствии индуктора стероид-1,2 дегидрогеназы - ацетата кортизона 20 мг/% в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 150 мл среды, на качалке (220 об/мин) при 30^oC в течение 24 часов. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 5000 g, дважды отмывают 0,01 М фосфатным буферным раствором, pH 7,2, и готовят суспензию клеток 50 или 100 мг (сухой вес)/мл буферного раствора, pH 7,0-7,2.

Трансформацию гидрокортизона проводят в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, содержащих 80 мл 0,01 М Na-фосфатного буфера, pH 7,0-7,2. Последовательно вносят 1,0 г микронизированного гидрокортизона и 5,67 г метил-ЦД, фирмы Wacker-Chemie GmbH, Германия, добавляют бактериальные клетки в виде суспензии в объеме 2,0 мл (0,2 г, вес сухой биомассы) и доводят объем реакционной среды до 100 мл фосфатным буфером. Концентрация субстрата - 10,0 г/л, соотношение субстрат:клетки (вес/вес) составляет 5:1. Трансформацию проводят в аэрируемых условиях при 220 об/мин, 30^oC в течение 5 ч. Процесс останавливают при отсутствии в среде гидрокортизона, т.е. при его полном превращении. По данным ВЭЖХ выход преднизолона составляет 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 1,88 г•л^-1•ч^-1.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 4,72 г метил-ЦД. Длительность процесса - 6 ч. Выход преднизолона составляет 95% (9,44 г/л). Гидрокортизон в среде отсутствует. Производительность процесса - 1,57 г•л^-1•ч^-1.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2,0 г гидрокортизона, 11,32 г метил-ЦД и 4 мл суспензии клеток (0,4 г). Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Процесс останавливают на 5 ч при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона - 97% (19,2 г/л). Производительность процесса - 3,85 г•л^-1•ч^-1.

Пример 4. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 9,44 г метил-ЦД. Полное превращение гидрокортизона осуществляют за 6 ч. Выход преднизолона - 97% (19,2 г/л). Производительность процесса - 3,21 г•л^-1•ч^-1.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 5,0 г гидрокортизона, 28,35 г метил-ЦД и 10 мл суспензии клеток (1,0 г клеток). Концентрация субстрата - 50,0 г/л. Процесс останавливают на 8 ч при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона составляет 96% (47,7 г/л). Производительность процесса - 5,96 г•л^-1•ч^-1.

Пример 6. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 23,63 г метил-ЦД. Процесс осуществляют за 8 ч и останавливают при отсутствии гидрокортизона. Выход преднизолона - 96% (47,7 г/л). Производительность процесса - 5,3 г•л^-1•ч^-1.

Пример 7. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 7,0 г гидрокортизона, 39,67 г метил-ЦД и 14 мл суспензии клеток (1,4 г клеток). Концентрация субстрата - 70,0 г/л. Полное превращение гидрокортизона осуществляют за 9 ч. Выход преднизолона составляет 95% (66,1 г/л). Производительность процесса - 7,42 г•л^-1•ч^-1.

Пример 8. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2 г гидрокортизона и 12,9 г ОПЦД фирмы Wacher-Chemie GmbH. Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Длительность процесса - 6 ч, выход преднизолона - 96% (19,0 г/л). Гидрокортизон отсутствует. Производительность процесса - 3,16 г•л^-1•ч^-1.

Пример 9. В ферментер, объемом 3,0 л, вносят 1,0 л 0,01 M Na-фосфатного буфера, pH 7,2 микрокристаллический гидрокортизон - 30,0 г, ОПЦД - 193,5 г и 6,0 г клеток в 60 мл буфера. Объем реакционной среды доводят до 1,5 л 0,01 M Na-фосфатным буфером. Концентрация субстрата - 20,0 г/л, соотношение субстрат: клетки (вес/вес) составляет 5:1. Трансформацию проводят при 30^oC, pO₂ 80-90% в течение 5 ч. Выход преднизолона при отсутствии гидрокортизона 96% (19,0 г/л). Производительность процесса - 5,72 г•л^-1•ч^-1.

Пример 10. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят 142,96 г метил-ЦД. Трансформацию проводят в течение 6 ч и останавливают при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона - 96% (19,0 г/л). Производительность процесса - 5,72 г•л^-1•ч^-1.

Пример 11. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2 г вещества "S" Рейхштейна и 11,86 г метил-ЦД. Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Процесс проводят за 8 ч и останавливают при отсутствии в среде субстрата. Выход 1,2-дегидрированного продукта 98% (19,48 г/л). Производительность процесса - 2,43 г•л^-1•ч^-1.

Пример 12. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2,0 г андростендиона (АД) и 14,36 г метил-ЦД. Полное превращение субстрата осуществляют за 6 ч. Выход андростадиендиона (АДД) - 95% (18,86 г/л). Производительность процесса - 3,14 г•л^-1•ч^-1.

Пример 13. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Иммобилизацию клеток A. globiformis проводят следующим образом. В предварительно охлажденную полимеризационную стеклянную камеру вносят 11 мл раствора, содержащего 1,9 г акриламида и 0,1 г N,N'-метиленбисакриламида, при перемешивании добавляют 3 мл раствора персульфата аммония (10 мг/мл), 6 мл суспензии клеток (50 мг/мл) и 3-4 капли концентрированного раствора N,N,N', N'-тетраметилэтилендиамина. Общий объем смеси - 20 мл. После начала гелеобразования полимеризационную камеру помещают в холодильную камеру с температурой минус 18^oC и выдерживают в течение 7-10 мин до завершения процесса полимеризации. Образовавшийся блок геля фрагментируют на гранулы диаметром 0,8-1,0 мм, продавливая его через сито с соответствующим размером ячеек. Полученные гранулы тщательно промывают 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,2, декантируют. Получают 30-35 мл гранул, содержащих по 6 мг клеток/мл гранул.

Трансформацию гидрокортизона осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вместо суспензии клеток вносят 34 мл гранул полиакриламидного геля (ПААГ). Соотношение гидрокортизон /иммобилизованные клетки - 5:1. Процесс проводят за 6 ч. Гидрокортизон в среде отсутствует. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 1,57 г•л^-1•ч^-1.

Пример 14. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят 15,0 г гидрокортизона и 86 г метил-ЦД. После доведения объема до 1,5 л добавляют 500 мл гранул ПААГ с включенными клетками. Полное превращение гидрокортизона завершают за 5 ч. Выход преднизолона - 96% (9,54 г/л). Производительность процесса - 2,83 г•л^-1•ч^-1.

Пример 15. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят гранулы ПААГ с включенными клетками, проводившими трансформацию гидрокортизона, описанную в примере 14. Полное превращение гидрокортизона в преднизолон осуществляют за 6 ч. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 2,35 г•л^-1•ч^-1.

Пример 16. Способ осуществляют по примеру 14, но в трансформационную среду вносят гранулы ПААГ с включенными клетками после проведения двух повторных трансформаций гидрокортизона, представленных в примерах 14 и 15. Процесс проводят за 10 ч. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Гидрокортизон в среде отсутствует. Производительность процесса - 1,4 г•л^-1•ч^-1.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить производительность процессов получения 1,2-дегидрированных производных 4-дельта-3-кетостероидов за счет полного превращения используемого субстрата в продукт при высокой исходной концентрации субстрата в среде. Способ не требует применения соединений, снимающих трансмембранный потенциал микробной клетки. Способ также позволяет избежать использования органических растворителей, применяемых в большинстве известных способов получения дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидров. Химически модифицированные ЦД могут быть регенерированы и многократно использованы.

Литература
1. Ахрем A.A., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. - М.: Наука, 1970.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Торсинг. Харьков, 1997, т.2, 590 с.

3. Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, pp.236-261.

4. Кoщеенкo К.A. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Пущино. 1978, т.2, с.55.

5. Аринбасарова А.Ю., Артемова А.А., Киселев А.В, Кощеенко К.А, Никитин Ю.С. Прикладн. биохим. микробиол. 1982, т.2, в.3, с. 331-338.

6. Koshcheenko K.A., Sukhodolskaya G.V., Tyurin V.S., Skryabin G.K. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981, V.12, pp. 161-169.

7. Kondo E. , Masuo E. J. Gen. Appl. Microbiol. 1970, v.7, N 2, pp. 113-117.

8. Авторское свидетельство СССР N 1514780, кл. C 12 P 33/00, C 12 R 1: 0,6. БИ N 3, 1989.

9. Патент РФ N 204195, кл. C 12 P 33/00, C 12 P 33/00//C 12 R 1:0,6. БИ N 23, 1995.

10. Авторское свидетельство СССР N 1471561, кл. C 12 N 11/04, 1985.

11. Патент НРБ N 71159, 1985.

12. Goetschel R., Bar R. Enzyme and Microbiol. Technology. 1992, v. 14, N 6, pp. 462-469.

13. Аринбасарова А.Ю., Меденцев А.Г., Акименко В.К., Кощеенко К.А. Биохимия. 1983, т. 48, N 10, с. 1726-1732.

14. Аринбасарова К.А., Кощеенко К.А. Прикл. биохим. микробиол. 1983, т. 19, в.1, с. 20-31.

15. Yamane T., Nakatani H., Sada E., Omata T., Tanaka A., Fukui S. Biotechnol. Biong. 1979, v.21, N 11, рр. 2133-2144.

16. Fernandes P., Cabral J.M.S., Pincheiro H.M. Enzyme Microbiol. Technology. 1995, v.17, N 2, pp.163-167.

17. Smolder A. S.S., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. Biotech. Bioeng. 1991, v.39, N.10, pp. 1210-1217.

18. Hoffman. Biotechnol. Lett. 1989, v.11, N 11, pp. 17-22.

19. Патент РФ N 2042687. Способ получения дегидроаналогов. Кл. 12 N 11/00. БИ N 24, 1995.

20. Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. D. Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, 625 p.

21. Patent GB N 2108965. Intensification of microbiological conversion of steroids by using cyclodextrin additives. 1981.

22. Алехина T.M., Рыжкова В.М., Гусарова Т.И., Куракова В.В., Клубничкина Г.А. Химико-фармацев. журнал. 1993, N 4, с.59-62.

23. Патент РФ N 1830949. Способ получения 1,2-дегидрированных кортикостероидов. Кл. C 12 P 33/00. БИ N 19, 1995.

24. Патент РФ N 2079258. Кл. C 12 P 33/16, C 07 J 1/00// (C 12 P 33/16, C 12 P 1:32). БИ N 3, 1997.

1,2-Дегидропроизводные 4-дельта-3-кетостероидов получают путем трансформации 4-дельта-3-кетостероидов, например гидрокортизона, вещества "S" Рейхштейна, андростендиона и др., бактериями Arthrobacter globiformis 193 в присутствии водорастворимых химически модифицированных производных бета-циклодекстрина (оксипропилциклодекстрина, метилциклодекстрина и др). Использование водорастворимых производных бета-циклодекстрина позволяет осуществлять трансформацию 4-дельта-3-кетостероидов при высоких (свыше 20 г/л) нагрузках субстрата при полном селективном превращении субстрата в продукт и высоких скоростях процесса. В результате увеличена производительность процессов получения необходимых медицине стероидных соединений.

Способ получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов путем трансформации 4-дельта-3-кетостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина, отличающийся тем, что в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные β-циклодекстрина.