Способ выращивания мицелиальных организмов Советский патент 1991 года по МПК C12N1/14 C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы.

На чертеже представлена установка для осуществления способа.

Способ заключается в том, что процесс выращивания мицелиальных организмов осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культураль- ной жидкости и локализации слоя мицелия внутри объема культуральной среды.

Установка содержит йерментер 1, крышку 2, перемешивающий узел 3 с пробкой 4 и штуцером 5, подключенным к генератору 6 пневмоимпульсов, штуцер 7 для ввода инокулята, штуцер 8 для отвода воздуха из Аерментера, штуцер 9 для отвода культуральной среды, штуцер 10 для ввода в Ьермен тер свежей питательной среды, насос 11, теплообменную рубашку 12, бу-4 тыли 13 и 14 для питательной среды и для сбора культуральной среды, бактериальные фильтры 15 и 16 и технологическую сеть трубопроводов 17. Перемешивающий узел 3 (устройство

со о

4

4

сл

для перемешивания и насыщения пита-.- тельной среды кислородом воздуха) содержит кусок силиконовой трубки диаметром 10„мм, которую размещают в , металлической трубе с боковым отводом Силиконовую трубку с одной стороны снабжают лепестковым клапаном, а затем герметично скрепляют с торцами металлического корпуса накидными гай-JQ ками со штуцерами. На металлический корпус одевают эластичную пробку, с помощью которой устройство вертикально закрепляют в крышке емкости , Ферментера АНКУМ-2 таким образом, $ чтобы штуцер находился на расстоянии 5-10 мм от дна этой емкости.

Установку стерилизуют в автоклаве в режиме 1 атм в течение 1 ч. Из бутыли 13 в ферментер 1 с помощью насо- 20 са 1 1 закачивают заданное количество питательной среды. Через штуцер 7 вводят посевной мицелий и включают генератор 6, пневмоимпульсы которого воздействуют на силиконовую трубку 25 перемешивающего узла 3, заставляя ее вибрировать с заданной частотой генератора 6. При поступлении пневмо- импульсов в перемешивающий узел 3 силиконовая трубка деформируется 0 с заданной частотой, вследствие чего образуется пульсирующий турбулентный газожидкостной поток, который активно насыщает слой питательной среды. оздух в Ферментер поступает через - бактериальный фильтр 15, установленный на бутыли 13 с питательной средой отводится из --ферментера в атмосферу через бактериальный фильтр 16, установленный на бутыли 14 для слива отаботанной жидкости. Заполнение полости перемешивающего узла питательной средой и воздухом и возврат образованг ной газожидкостной смеси в ферментер араллельно с насыщением питательной .с среды кислородом воздуха и перемешианием придонного объема питательной среды вызывают колебания всего объема ультуральной жидкости с амплитудой 1-3 мм и частотой, заданной генератоом, и обеспечивают пассивное (ламиарное) -перемешивание культуральной идкости в приповерхностном объеме Ьерментера.

При амплитуде колебаний гидроста1 тического столба культуральной жид ости 41 мм происходит обрастание мицелием стенки ферментера, а при амплитуде 3 мм увеличиваются энерге35

40

„ 55

0 5 0 с

5

0

5

тические затраты на проведение процесса. Частота колебаний гидростати- ческого столба культуральной:жидкости выбирается, исходя из возможностей технологического оборудования,

В процессе перемешивания в момент внесения в питательную среду посевного материала осуществляется его равномерное распределение по всему объему культуральной жидкости. В/.процессе культивирования происходит рис- слоение культхральной жидкости на слой, содержащий биомассу, и жидкую фазу (кулвтуральную среду), Плотная биомасса растущего мицелия при пассивном (ламинарном) перемешивании, вызываемом колебаниями гидростатического столба культуральной жидкости, препятствует образованию пены и зарастанию стенок ферментера.

Периодически в процессе роста по мере исчерпания, субстрата культураль- ную жидкость, образующуюся вне слоя мицелия, сливают в бутыль 14, а в йерментер заливают новую порцию исходной питательной среды из бутыли 13. В результате весь объем ферментера может быть заполнен биомассой.

Для реализации способа может быть использовано любое ферментационное оборудование, обеспечивающее насыщение жидкости газом и позволяющее осуществить колебание объема культуральной жидкости с амплитудой Т-3 мм, например аппараты, перемешивающие устройства, в которых устанавливают вблизи дна БИОР-01 и БИОР-025. При этом Ферментационная емкость должна быть снабжена устройством для колебания гидростатического столба жидкости от воздействия пневматического ; или гидравлического приводов.

Для иллюстрации работы способа используют либо ферментационную емкость от аппарата АНКУМ-2, в котором вместо традиционного перемешивающего узла используют устройство для перемешивания и газонасыщения питательной среды, либо колбы Бунэена, снабженные аналогичным устройством.

Пример 1. Гриб Panus tigri- nus 8/18 смывают с косяка 10- мл сте- рильной водопроводной воды, вносят в ферментер, сконструированный из колбы Вунзена, куда предварительно загружают 400 мл питательной среды следующего состава, г/л глицерин 25,0; пеп

тон 5,0;.соевая мука 2,5; КШз 2,0; СаС1«, б/в 0,5; MgSO 7HU0 OJ1.

Для осуществления аэрации культу- ральной жидкости с придонного объем ферментера с частотой 3 Гц отбирают 50 мл питательной среды, которую перемешивают с воздухом в турбулентном потоке и возвращают в придонный объем ферментера. Соотношение объема перемешивающего узла к диаметру ферментера выбирают из расчета колебания гидростатического столба рабочей жидкости с амплитудой 3 мм. Объе культуральной жидоксти перемешивающего узла составляет 50 мл, а диаметр колбы Бунзена 80 мм, что приводит к изменению гидростатического столба рабочей жидкости в ферментере с амплитудой 3 мм. Выращивание мицелия проводят при te24°C. Через 3 ч после инокулирования гриб равномерно распределяется по всему объему среды. Через 6 ч начинает формироватся рыхлый верхний слой, но часть миц лия еще распределяется по всему объему среды. Через 12 ч после посева весь мицелий гриба занимает верхний елой культуральной жидкости, а в придонном слое активного перемешивания питательной среды имеются отдельные вкгйочения биомассы. Через 14 ч после посева весь растущий мицелий флотирует в приповерхностный объем колбы, а под ним находится прозрачная с ярко- желтой окраской культуральная среда, не содержащая основного субстрата. Культуральную среду через каждые последующие 10 ч сливают в бутыль, а в ферментер загружают исходную питательную среду до уровня рабочего объ

ема

Через 71 ч выращивания нижняя поверхность мицелиальной массы находится на высоте 15-20 мм от дна ферментера, что вызывает турбулизацию мице- лиального слоя и затрудняет перезагрузку питательной средой, в связи с чем процесс останавливают.

Концентрация биомассы к концу процесса составляет лМЗ, г/л, что в л/2,6 раза больше, чем в известном способе, где концентрация биомассы составляет 5 г/л. Плотность локализованного слоя биомассы составляет 18,4 г/л

II

( , где В - количество биомассы

В

Ґ

в граммах по сухому весу; - объем слоя мицелия в культуральной жидкос

ти, л; Р - плотность биомассы, г/л),

0

5 вают через

0

5

Микроскопическ.ий контроль показыва- ., ет в пробах отсутствие мицелия с по- врежденными гифами, что свидетельствует об активном физиологическом состоянии биомассы.

Пример2. Емкость от ферментера АНКУМ2, оборудованную перемешивающим узлом, подключают к бутыли с питательной средой и бутыли для сбора культуральной среды. В «Ьерментер заливают 700 мл питательной среды состава, указанного в примере 1, ги вно5 сят 5 мл грибной суспензии P.tigri-1 v tius 8/18, выращенной по примеру 1. Культивируют при амплитуде гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм. Через 10 ч культивирования мицелий собирается в приповерхностном объеме ферментера. Через 20, 44 и 58 ч роста в Лерментере производят замену культуральной среды на свежую питательную среду. Процесс останавли . . 92 ч. В объеме 700 сма

грибной мицелий занимает объем 400 см 157 об.%), что составляет 10,8592 г (с.в.) биомасы гриба. Концентрация биомассы составляет 15,6 г/л, что в 3,1 раза больше, чем в известном способе. Плотность локализованного слоя биомассы составляет 27,2 г/л. Микроскопический контроль подтверждает отсутствие мицелия с повреждении-4 ми гифами в препаратах биомассы.

ПримерЗ. В ферментер емкостью 600 мл вносят 200 мл питательной среды и 10 мл суспензии гриба Panus tigrinus 144, выращенного в колбе. Состав среды и условия культивирования как в примере 1. Культи- вирумт при амплитуде колебаний гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм,

После Нормирования плотного верхнего слоя мицелия на протяжении ферментации по мере исчерпания основного субстрата три раза в сутки сливают культуральную среду, заменяя ее порQ цией питательной среды, поддерживая постоянным рабочий объем ферментера. Через 6 сут процесс останавливают, так как визуально грибной мицелий занимает почти весь объем ферментера. Из 200 см рабочего объема мицелий занимает см (70 об.%). Этот объем сырого мицелия содержит 9,6251 г абсолютно сухой биомассы. Концентрация биомассы составляет

5

0

71636445

48,1 г/л, что в 9,6 раза больше, чем в известном способе. Плотность локализованного слоя биомассы составляет г/л. Микроскопический контроль показывает в пробах, отбираемых во время замени среды, отсутствие мицелия с поврежденными гифами,

П р и м е р 4. Актиномицет Strep - tomyces tumemacerans ВКМ-502, синте- JQ зирующий метаболиты с инсектицидными свойствами, выращивают1 в колбах на среде состава г/л: лактоэа 2,0; соевая мука,-15,0; дрожжевой эктракт5,0; ( рН 7,0-7,2, в течение 4 js на .качалке {200 об./мин), По- 1 лученный посевной материал вносят в Ферментационную среду состава, г/л: крахмал 15,0; глюкоза 1,5; соевая мука 20,0; сухие дрожжи 5,0; NaCl 20 2,5; СаСОэ 3,0; СоСЦ , 0,05; рН 7,2, в ферментер с рабочим объе- мом 1 л и проводят выращивание клеток в течение 5 сут как описано в примере 1. Амплитуда колебаний гидро- 25 статического столба культуральной жидкости составляет 1 мм. В конце первых суток на поверхности фазового раздела и по периметру царги (прорс

с ч 9 б

в к п б э

зрачная стенка Ферментера) образуют- зр и аэрацию, осуществляемую в ее лося заметные невооруженным глазом скопления мицелиальной биомассы,котог рые к концу 2 сут образуют рыхлый слой биомассы толщиной 8-10 мм, перекальной зоне, отличающий- с я тем, что, с целью повышения вы хода биомассы, перемешивание осуществляют воздействием колебаний с

8

мвшивания в ферментере наблюдается расслоение мицелиального слоя биомассы, который увеличивается в 2 раза и имеет толщину 30 мм.

Через 96 ч процесс останавливают. К этому моменту плотный слой биомассы в ферментере имеет толщину 67 мм, что составляет 50% его рабочего объема Концентрация биомассы составляет 9,5 г/л сухого вещества, что в Р Л1,4 раза больше, чем при выращивании известным методом. Плотность слоя биомассы составляет 19 г/я«

Таким образом, предлагаемый способ выращивания мицелиальных организмов позволяет повысить выход биомассы в культуральной жидкостное 3-ГО раз по сравнению с известным способом, упростить процесс -выделения экзомета- болитов, а также увеличивает произво- деятельность аппарата при снижении энергозатрат, Формула изобретения

Способ выращивания мицелиальных организмов, предусматривающий перемешивание культуральной жидкости, помещенной в замкнутый объем ферментера,

и аэрацию, осуществляемую в ее локальной зоне, отличающий- с я тем, что, с целью повышения выхода биомассы, перемешивание осуществляют воздействием колебаний с

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, медицинской и микробиологи- ческой промышленности. Цель изобретения - повышение выхода биомассы мицелиальных организмов. Процесс выращивания Panus tigrinus 8/18, Panus tig- rinus 144, Streptomyces tumemacerans BK№-502 осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культуральной жидкости и локализации мицелия внутри объема кулвтуральной среды в придонном слое. Перемешивание культуральной жидкости проводят посредством колебаний гидростатического столба всего ее рабочего объема с амплитудой колебания 1-3 мм. Аэрацию осуществляют через насыщение кислородом воздуха придонного слоя. В процессе культивирования отработанную культу- ральную среду, образующуюся над слоем мицелия, замещают свежей питательной средой. 1 ил (Л

крывающий всю поверхность культураль- ,, амплитудой 1-3 мм имеющегося объема

ной жидкости в ферментере. Под слоем биомассы находится прозрачная отработанная среда, не содержащая основно- го субстрата.

После замены питательной среды, Q восстановления режима аэрации и пере-

культуральной жидкости с получением слоя биомассы и жидкой фазы, в качестве локальной зоны для аэрации используют придонный слой, а жидкую фазу, | свободную от биомассы,периодически за , мешают свежей питательной средой.

культуральной жидкости с получением слоя биомассы и жидкой фазы, в качестве локальной зоны для аэрации используют придонный слой, а жидкую фазу, | свободную от биомассы,периодически за- , мешают свежей питательной средой.

Составитель В. Соина Редактор Н. Яцола Техред Л.Олийнык Корректор М.Самборская

Заказ 796

Тираж 379

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное