Способ получения конъюгата авидина с коллоидным золотом Советский патент 1991 года по МПК C12N11/00 G01N33/53 

Изобретение относится к области анализа биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологических материалов с помощью, электронной микроскопии.

Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта.

Способ получения конъюгата авидина (А) с коллоидным золотом (КЗ) заключается в стабилизации золя КЗ путем смешивания с водным раствором сывороточного им-муноглобулина Г (ИгГ), отделением несвязавшегося.ИгГ (например, ультра- центрифугированием или гель-хроматографией) и последующим смешением с авидином, предварительно активированным 1-16%-ным раствором глутаровогоальдегида при мольном отношении ави- дин: КЗ 20-200:1, с последующим закреплением авидина в конъюгате обработкой 0,002-0,02 молярным раствором (0,08- 0,8 г/л) боргидрида натрия и отделением несвязавшегося авидина (например, гель- хроматографией или ультрацентрифугированием). Чувствительность метода визуализации на его основе составляет 2-3 пг био-ДНК в пробе, а время жизни такого конъюгата превышает 7 мес (свойства коньюгата не изменяются в течение 7 мес с момента его получения). Чувствительность метода визуализации с использованием конъюгата, полученного известным способом, около 20 пг био-ДНК в пробе, а время жизни такого конъюгата 3-4 нед.

П р и м е р 1. Получение конъюгата авидина с коллоидным золотом через иммуноглобулин Г.

А. К 60 мл 0,005% золя золота (размер частиц 10 + 2 нм, оптическое поглощение при длине волны 520 нм (D520 0,8, мольная концентрация 8 х моль/л) в 0,01 М растворе КаСОз при рН 9,5 добавляют при перемешивании 1 мл раствора ИгГ(2,3 мг/мл, отношение ИгПКЗ 30:1) в 0,01 М растворе КаСОз при рН 9,5 (изоэлектрическая точка ИгГ7,5). Смесь выдерживают30 мин и затем добавляют бычий сывороточный альбумин до концентрации 1 мг/мл. Выделение КЗ, стабилизированного ИгГ (И-КЗ), проводят методом гель-хроматографии.

Б. Присоединение авидина к И-КЗ. К 0,5 мл раствора авидина (2 мг/мл) в 0,1 М КНСОз при рН 9,0 добавляют 0,05 мл 25%- ного раствора глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин и затем наносят на колонку размером 1 х 20 см, заполненную сорбентом Sephaclex G-50 (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,1 М раствором КНСОз рН 9,0. Элюцию ведут в том же буфере со скоростью 20 мл/ч. В данных условиях происходит полное отделение активированного авидина от непрореагировавшего глутарового альдегида. Фракции, содержащие авидин, объединяют и добавляют к 2 мл раствора I/I-КЗ (Dsao 5,0, отношение ави- дин:КЗ 150:1).в 0,1 М КНСОз при рН 9,0. Через 30 мин добавляют 0,02 М раствор боргидрида натрия до конечной концентрации 0,002-0,01 М. Смесь выдерживают 30 мин и затем добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 10 мг/мл. Выделяют образовавшийся конъ- югат АИ-КЗ методом гель-хроматографии.

Испытания- конъюгатов А-КЗ и АИ-КЗ. Нитроцеллюлозные фильтры с нанесенной био-ДНК в диапазоне 10 нг - 0,1 пг инкубируют в растворе конъюгата А-КЗ или АИ-КЗ

(Dsao 0,5) в присутствии 0,1 М К2НР04, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в течение часа, промывают в течение часа в трех сменах раствора 0,1 М

К2НР04 и 0,1% детергента Tween-20 и в течение 15 мин в бидистиллированной воде. После этого проводят физическое серебряное усиление по стандартной методике. Серебряный усилитель (0,077 М гидрохинон,

0,0055 М лактат серебра в 0,2 М цитратном буфере, рН 3,85) готовят непосредственно перед употреблением смешиванием 10 мл концентрированного цитратного буфера (23,5 гтринатрийцитрата дигидрата и 25,5 г

гидрата лимонной кислоты на 100 мл воды), 60 мл воды, 15 мл раствора гидрохинона (0,95 г на 15 мл воды) и 15 мл раствора лактата серебра (0,11 г на 15 мл воды). Усиление ведут 20 мин при красном свете, поеле чего закрепляют изображение в фотографическом фиксаже и отмывают в воде. Затем фильтры высушивают и фотомет- рируют в отраженном свете на приборе ДО-1. Достоверным считают сигнал, превышающий на 0,1 оптическую единицу фон (3-кратное превышение паспортной точности измерения прибора ДО-1), а соответствующее этому сигналу количество био-ДНК определяют как чувствительность метода.

Испытания конъюгатов проводят сразу после получения, через 40 дней и через 200 дней хранения в растворе 0,1 М К2НР04 и 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в холодильнике (4°С). Результаты испытаний приведены в табл. 1.

П р и м е р 2. Подбор концентраций глутарового альдегида (ГА) при обработке авидина.

Опыт проводят так же, как в примере 1.

Изменяют концентрацию ГА при обработке авидина. Испытания полученных конъюгатов проводят, как в примере 1. Результаты представлены ниже:

П р и м е р 3, Подбор отношения ави- дин:КЗ.

Опыт проводят аналогично примеру 1. Изменяют отношение авидин:КЗ. Испытания полученных конъюгатов проводят, как в примере 1. Результаты приведены ниже:

П р и м е р 4. Подбор условий обработки боргидридом натрия.

Опыт проводят, как в примере 1. Изменяют концентрацию боргидрида натрия. Испытания проводят, как в примере 1. Результаты представлены в табл. 2.

П р и м е р 5. Влияние соотношения ИгПКЗ на чувствительность визуализации с использованием этого конъюгата приведено ниже:

При ИгГ:КЗ б золь неустойчив и легко коагулирует при уменьшении рН или добавлении соли; при ИгПКЗ 6-30 комплекс устойчив к указанным воздействиям, но частицы КЗ еще способны сорбировать дополнительные порции молекул иммуноглобулина Г (ИгГ); при соотношении ИгГ.КЗ S 30 поверхность частиц КЗ насыщается и последующие порции ИгГ остаются в растворе, т.е. образуется стабильный комплекс постоянного состава. Для получения конъюгата важным является именно стабильность по составу получаемого комплекса иммуноглобулина Г с ко/ лоидным золотом, Использование именно такого стабилизированного комплекса для получения конечного конъюгата давало наилучшие результаты. При использовании комплекса.

который не подвергался стабилизации по составу (т.е. при соотношении ИгПКЗ 30), конъюгаты получались с более низкой чувствительностью.

Перед связыванием с глутарирован- ным авидином комплекс иммуноглобулина Г с коллоидным золотом отделяется от избытка молекул ИгГ, не связавшихся с КЗ.

Соответственно в реакцию вступает стабилизированный комплекс ИгГ-КЗ и эффективность реакции определяется соотношением авидин:ИгГ-КЗ, численно равным приведенному соотношению авидинжоллоидное зол ото (2 0-2 00 :1).

Для стабилизации золя КЗ могут быть использованы ИгГ из сыворотки быка, человека и в основном лошади (как наиболее дешевый). Все они дают целевые конъюгаты

авидина с КЗ с одинаковыми свойствами.

Использование ряда других белков (все они дают менее прочные комплексы с КЗ) приводит к получению конъюгата авидина с КЗ с гораздо более низкой чувствительностью (опыты проводят аналогично примеру 1, только вместо ИгГ используют бычий сывороточный авидин, овальбумин и цитох- ром С).

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать конъюгаты авидина с КЗ улучшенного качества. Так, чувствительность визуализации био- тинсодержащих веществ возрастает в 10 раз (до 2-3 пг вместо 20 пг), а стабильность - с 3-4 нед до 7 мес.

Формула изобретения Способ получения конъюгата авидина с коллоидным золотом, включающий обработку золя коллоидного золота 20-200-кратным молярным избытком авидина и отделение несвязавшегося авидина, о т- личающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, перед обработкой авидином золь коллоидного

золота стабилизируют водным раствором сывороточного иммуноглобулина Г при соотношении иммуноглобулина и коллоидного золота 30-100:1 с последующим отделением несвязавшегося иммуноглобулина, авидин предварительно активируют 1-16%-ным глутаровым альдегидом, а после обработки золя авидином конъюгат инкубируют в присутствии 0,002-0,02 М раствора боргидрида натрия.

Таблица 1

Изобретение относится к анализу биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологического материала с помощью электронной микроскопии. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет увеличения его стабильности. Способ заключается в присоединении авидина к коллоидному золоту при обработке золя золота 20-200-кратным мольным избытком авидина с последующим отделением несвязавшегося авидина, при этом перед присоединением авидина золь стабилизируют сывороточным иммуноглобулином G при соотношении 30-100:1 с отделениемнесвязавшегося иммуноглобулина, а авидин активируют обработкой 1-16%-ным раствором глутарово- го альдегида, после присоединения авидина его закрепляют в конъюгате обработкой 0,002-0,02 М раствором боргидрида натрия. Использование предлагаемого способа позволяет улучшить качество целевого продукта за счет увеличения его стабильности в 7-9 раз, а также повышения чувствительности визуализации с использованием целевого продукта в 10 раз. 2 табл. fcrf fe а со со сь со

Таблица 2