СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНЫХ И РАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ МЕТОДОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/532 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно - к лабораторной диагностике, и может быть использовано для приготовления диагностикума с целью обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа.

Несмотря на то что в практике здравоохранения используется ряд методов для обнаружения антигенов бруцелл, они, к сожалению, не лишены ряда существенных недостатков. Поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных методов лабораторной диагностики бруцеллеза являются актуальными.

В последнее время в практических лабораториях для обнаружения антигенов бруцелл используют либо метод флуоресцирующих антител, либо иммуноферментный анализ (Т. Ю. Загоскина, С.П. Меринов. Характеристика рутинных методов выявления антигенов бруцелл // Журн. инфекцион. патологии. - 1998. - Т. 5. - 4. - С. 12-17). Однако их широкое внедрение ограничено отсутствием качественных коммерческих диагностикумов, а также необходимостью соответствующего приборного обеспечения лабораторий.

Наиболее близким к предлагаемому является способ приготовления диагностикума для обнаружения антигенов бруцелл с помощью противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным золотом (Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. - 1998. - 6. - С. 64-68). Однако данный способ имеет существенные недостатки: предполагает использование дорогостоящих (импортных) реактивов - золотохлористоводородной кислоты и лактата серебра - и оборудования - ультрацентрифуги.

Цель изобретения - удешевление, повышение технологичности и доступности способа приготовления диагностикума.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве маркера противобруцеллезных IgG используют золь серебра, который получают обработкой 0,035%-ного раствора азотно-кислого серебра равным объемом 0,05%-ного раствора боргидрида натрия. Созревший золь дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, добавляют к водному раствору противобруцеллезных IgG в соотношении по объему 10: 1. Через 30 мин после добавления последней порции золя в диагностикум вносят равный объем фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят восстановлением из водного раствора 0,035%-ного азотно-кислого серебра равным объемом 0,05%-ного раствора боргидрида натрия. Полученный золь дробно, в три приема с интервалом по 10 минут, добавляют к раствору противобруцеллезного IgG в соотношении по объему 10: 1, соответственно, через 30 минут после добавления последней порции золя в смесь вносят равный объем фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ приготовления диагностикума для дот-иммуноанализа на основе противобруцеллезного IgG, меченного коллоидным серебром, который бы использовался для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл. Предлагаемые режимы приготовления диагностикума позволяют достичь поставленной цели - удешевление, повышение технологичности и доступности способа приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа. При этом способ прост, но эффективен, позволяет получать качественный диагностикум, не используя дорогостоящих реактивов и оборудования. Данный диагностикум может производиться и применяться в клинических, ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой бруцеллеза.

Таким образом, предлагаемый способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа выполняется следующим образом: к 0,0035 г азотно-кислого серебра, растворенного в 10 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,005%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь встряхивают в течение 15 мин при комнатной температуре для созревания золя, который дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, добавляют к 2 мл водного раствора противобруцеллезного IgG концентрацией 0,8 мг/мл. Через 30 мин после добавления последней порции золя в реакционную смесь вносят равный объем 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия и выдерживают 30 мин.

Пример. К 0,0035 г азотно-кислого серебра, растворенного в 10 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,005%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь встряхивают в течение 15 мин при комнатной температуре для созревания золя, который дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, добавляют к 2 мл водного раствора противобруцеллезного IgG концентрацией 0,8 мг/мл. Через 30 мин после добавления последней порции золя в реакционную смесь вносят равный объем 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия и выдерживают 30 мин.

Диагностикум, приготовленный данным способом, апробирован в дот-иммуноанализе при исследовании 250 проб (штаммы бруцелл всех известных видов, искусственно контаминированные объекты внешней среды, материал от больных людей и экспериментальных животных). Чувствительность дот-иммуноанализа при использовании диагностикума составила ≥6,1•10⁴ м.к./мл корпускулярных и ≥9 нг/мл растворимых антигенов бруцелл. Ложноположительных результатов с гетерологичными микроорганизмами не отмечалось. Аналогичные данные получены при исследовании материала в дот-иммуноанализе с IgG, меченными коллоидным золотом. Однако предлагаемый диагностикум значительно дешевле, доступнее, технологичнее, способ его приготовления прост, не требуется оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. Использование диагностикума в дот-иммуноанализе позволяет быстро и качественно осуществлять обнаружение корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно - к лабораторной диагностике. Способ осуществляется путем приготовления золя серебра и добавления полученного золя к водному раствору противобруцеллезного IgG. Далее полученную смесь стабилизируют внесением фосфатного буфера, содержащего сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Способ приготовления диагностикума дешев, технологичен, доступен, позволяет отказаться от дорогостоящего оснащения, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность результатов дот-иммуноанализа.

Способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа, включающий приготовление золя коллоидного металла и добавление его к раствору иммуноглобулина G, отличающийся тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят обработкой 0,035%-ного водного раствора азотно-кислого серебра равным объемом 0,05%-ного раствора боргидрида натрия, затем его дробно, в три приема с интервалом по 10 мин добавляют к раствору противобруцеллезного IgG в соотношении по объему 10:1 соответственно, через 30 мин после добавления последней порции золя в смесь вносят равный объем фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.