Способ получения бактериального пирогена Советский патент 1991 года по МПК C12N15/03 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к -получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил организма.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

В качестве источников липополи- сахаридов (ЛПС) используют экспериментально полученные методом половой конъюгации с использованием высокоэффективных доноров эшерихий группы HfrHW) гибриды шигелл Флекснера и эшерихий, проводят предварительное удаление клеточных липидов, лиофили- зацию, суспендирование биомассы в дистиллированной , многократное воднофенольное экстрагирование (2:1) с использованием свежеперегнанного фенола (температура экстракции 65 - 70°С) с последующим центрифугированием 3000 об/мин, 20 мин), диализом в течение 3 сут через пергаментную бумажа

ел

ную мембрану с размером пор 10-20А, Удельной поверхностью пор 1000- 1200 ма/г и толщиной 0,16-0,20 мм, предварительно промытую хлороформ- метанольной смесью (2:1) для обезжиривания, упаривания при с использованием жидкого азота, ультрацентрифугированием в режиме: tOSOOOg, 1 ч, три раза, с последующей лиофильной сушкой полученных продуктов.

Пример. Проводят генетическую рекомбинацию бактерий с использованием донора E.coli HfrH (fl), (str5, mon1, ), реципиента

sh.flexneri № 737 тип 2а (strr, neo). Получают половые гибриды (ге- нетичаские рекомбинаты) шигелл Флекс- нера и эшерихий HfrHCft), три штамма: R-737-2, R-737-4 и R-737-6, которые обладают одинаковыми биологическими характеристиками: грамотрицательным,

iнеподвижны, устойчивы как к ртрепто- мицину9 так и к антибиотикам резерва

|(strps monr, пео), активны в отно- шении к лактозе, что используют вместе со стрептомицкнрезистентностью как важный селективный признал для отбо ра рекомбинантов. По вирулентности

(половые ргкомбинаты следуют за реципи ентной культурой Sh. flexneri № 737 серотип 2а ( составляет 133i t 47 млн.микробных тел). Так как все

три штамма рекомбинантов имеют близкие биологические характеристики, то для дальнейших исследований отбирают R-737-4, отличающийся наиболее высокой стабильностью морфотинкто риальных и биохимических показателей.

Биомассу бактериальных культур выращивают на стандартных плотных средах МПА одной серии изготовления. Отмыв культур от остатков среды производят раствором натрия хлорида с массовой долей 0,50% до отрицатель- ной реакции с нингидрином. Чистоту выросших колоний проверяют микроскопическим путем. Биомассу бактерий высушивают на воздухе. Удаляют клеточные ЛИПИДЫ.

Остаток биомассы лиофильно высушивают, делят на три равные части и суспендируют каждую в дистиллированной воде при 37°С, затем каждую порцию обрабатывают фенолводной смесью (1 ;2,V/V)c использованием свежеперегнанного фенола при 65-70°С(5 раз) слученные экстракты объединяют и центрифугируют (3000 об/мин) ,диализуют через

5 Q

0

пергаментную бумажную мембрану с размером пор 10-20 А, удельной поверхностью пор 1000-1200 мг/г и толщиной 0,16-0,20 мм, предварительно обезжиренную хлороформ-метанольной смесью (2:1) в течение 3 сут, меняя воду через каждые 6 ч, упаривают на ротЬрном испарителе с использованием жидкого азота (), полученные экстракты центрифугируют в следующем режиме: 108000s, 1 ч, 3 раза. Полученные продукты лиофилизуют. Выход рассчитывают по данным весового анализа.

Общая характеристика состава АПС и их выхода у генетических рекомбикан- тов и исходных культур донора и реципиента дано в табл. 1.

Выход ЛПС наибольший у половых f гибридов (табл 1). ЛПС каждой из культур гидролизуют 1%-ной уксусной кислотой (50 мл, 2 ч. 100°С) в за- iпаянных ампулах. Переосаждение липи- да А производят пятикратным объемом ч ацетона.

Липид А (10 мг) гидролизуют соляной кислотой (С (1/1 НС1)4 моль/л; 12 4J 100°С) в запаянных стеклянных ампулах. Жирные кислоты экстрагируют хлороформом с последующим упариванием и метилированием диазометаном. Проводят контроль чистоты фракции метиловых зфиров. Газожидкост- ную хроматографию проводят, используя хроматограф с пламенно-ионизационным детектором при условиях: колонка 0,5 см х 35 м, температура колонны 180 С, фаза Sp-ЮОО. Хромато- масс-спектрометрию метиловых эфиров Ж ведут на приборе (колонка та же). Осуществляют интерпретацию масс- спектров Определяют общее содержание белка в ЛПС, нуклеиновых кислот, нейтральных моносахаридов фенолсерно- кислым методом, находят содержание кетодезоксио ктоновой кислоты (КДО), рассчитывают массовую долю суммарного фосфора в ЛПС. Фенола в препаратах че обнаруживают.,

Полученные данные статистически обраОачъшают с учетом распределения Стьюден та-Фише ра.

После выхода пирогенной кривой на режим пирогенала производят сравнительное изучение действия ЛПС в зависимости от источника и дозы препарата. Данные статистически обрабатывают с учетом распределения Стьюдента-Фишера.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что половые гибриды являются более лучшими эндопродуцентами ЛПС, чем исходные эщерихии (в 2 рза) E.coli HfrH(fT) и шигеллы. Средняя температура режима пирогенного эффекта у ЛПС гибридов составляет 40,5°С при 40,OtfC у пирогенала.

Содержание жирных кислот и углеводов в липиде А генетических реком- .бинантов и исходных культур-донора и реципиента приведено в табл. 2.

wТаким образом, предлагаемый способ получения бактериального пироге- на является новым и на основании биотестирования обладает температурой и временной компонентой пиро- генного эффекта, свидетельствующей о его усилении в сравнении с пиро- геналом.

1640165

Ф о

v

рмула изобретени

Способ получения бактериального

пирогена, предусматривающий экстракцию пирогена из бактерий с последующим диализом в течение 3 сут ульт- рацентрифугированием и лиофилизацией целевого продукта, отличагащ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, пиро- ген экстрагируют из генетических ре- комбинантов шигелл Флекснера и Eshe- richia coli HfrH(lp) ЗЗХ-ной водно5 фенольной смесьга при 70°С после предварительного суспендирования в дистиллирозанной воде, а диализ осуществляют через обезжиренную перга- бумагу с размером пор 1020 А, удельной поверхностью пор 1000- 1200 м2/г и толщиной 0,16-0,20 мм со сменой диализной воды через 6 ч.

Т а 5 л и ц а 1

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в следующем. В качестве источников используют экспериментально полученные методом половой конъюгации с использованием высокоэффективных доноров эшерихий группы HfrH(/T) гибриды шигелл Флекснера и эшерихий. Проводят предварительное удаление клеточных липидов, лиофили- зацию, суспендирование биомассы в дистиллированной Н-0, многократное воднофенольное экстрагирование (2:1) с использованием свежеперегнанного фенола, температура экстракции 65- 70°С с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), диализом в течение 3 сут через пергаментную бумажную мембрану с размером пор 10- 20 А, удельной поверхностью пор 1000- 1200 мг/г и толщиной 0,16-0,20 мм, предварительно промытую хлороформ- метанольной смесью (2:1) для обезжиривания, упаривание при 30°С с использованием жидкого азота, ультра- центрифугирование в режиме: 108000 об/мин, 1 ч, три раза с последующей лиофильной сушкой полученных продуктов. 2 табл. с/ с

Таблица 2