Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу выявления эндотоксинов (липополисахаридов) грамотрицательных бактерий с различной антигенной специфичностью боковых углеводородных цепей.

Известен способ выявления липида А или гликолипида путем проведения еакции торможения пассивной гемаглютинации с использованием эритроитов, сенсибилизированных гликолиидом или липидом А ij.

Основной недостаток этого способа состоит в том, что он позволяет выявлять липид А или гликолипид лишь после их предварите тьного химического выделения из липопол 1сахаридов или из бактериальных клеток. В отношении липополисахаридов, циркулирующих во внемней среде или в организме человека и животных, этот способ характеризуется крайне низкой чувствительностью, так как нативные .. липополисахариды практически не тормозят реакцию пассивной гемагглютинадии с гликолипидным или липидным диагностикумами.

Целью изобретения является .повышение специфической чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами, сенсибилизированными гликолипидом из мутанта Salmonella minnesota R595 исследуемые пробы предварительно обрабатывают 0,10-0,25 М раствором гидроокиси натрия при 56-100°С в течение 10-120 мин с последующей нейтрализацией раствором соляной кислоты,.

Способ осуществляют следующим образом,

Получени г гликолипида, 30 г лиофильно высушенной биомассы мутанта Salmonella minnesota R595 экстрагируют трижды смесью хлороформ:метанол в соотношении 4:1. Объем смеси при первой экстракции составляет 450 мл, при послёдук)щих двух - по 200 мл. Объединенные экстракты доводят метанолом до конечного соотношения хлороформа и метанола, равного 1:2, и оставляют на 2 ч при 4°С,затем осадок, содержащий гликолипид, отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин. Полученный осадок переосаждают трижды при помощи той же процедуры, после чего высушивают на воздухе. Выход сухого продукта - около 850 г. Препарат гликолипида хранят в высушенном виде при 4°С.

Получение формалинизироваиных Эритроцитов, Свежие эритроциты отмывают 0,15%-ным раствором хлористого натрия от плазмы и суспенди- i руют в стандартном солевом растворе (ССР), содержащем 4,5 г цитрата,8,8 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды, до 5%-ной концентрации и диализуют против формалина (1/5 объема формалина от объема взвеси эритроцитов) в течение 5-6 сут при , периодически помешивая,

0 После диализа эритроциты отмывают ССР, готовят 50%-ную взвесь в ССР с 1% формалина и хранят при 4с.

Получение водорастворимого гликолипида. 10 мг гликолипида растворяют в 10 мл деионизированной воды при добавлении триэтиламина до конечной концентрации 1%. Затем добавляют мл раствора, содержащего бычий сывороточный альбумин в концентра0 Ции 2 мг/мл, перемешивают и отгоняют триэтиламин на роторном испарителе. Затем раствор, содержащий комплекс гликолипида с БСА, разводят в 5 раз 0,2 М фосфатным буфером рН

5 6,4 до концентрации гликолипида 200 мкг/(л.

Сенсибилизация эритроцитов, 5 мл 50%-ной суспензии формализированных эритроцитов трижды отмывают ССР от формалина, 5 мг танина растворяют в 195 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР) рН.7,2 (100 мл Of 15 М раствора хлористого натрия + 100 мл 0,15 М натрия-фосфатного буфера) , суспендируют в этом же растворе .формалинизированные эритроциты, инкубируют 10 мин при 31°С и отмывают дважды ЗФР путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 15 мин, К осадку добавляют 50 мл ЗФР (

0 (рН 6,4), содержащего комплекс гликолипида с БСА в концентрации 200 мг гликолипида в 1 мл. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, отмывают трижды ССР, содержащим 0,03% БСА (ССР-БСА).

5 готовят 1%-ную суспензию эритроцитов в этом же растворе, добавляют формалин до конечной концентрации 1% и хранят при 4°С.

Щелочный гидролиз эндотоксинов,

Q 2 мг ЛПС растворяют в 0,75 мл дистиллированной воды, содержащей 0,05 М этилен-диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) , и добавляют 0,25 мл 1М NaOH, Смесь выдерживают при 56°С 1 ч,

е Концентрация щелочи варьирует в пределах 0,1-0,25 М, температура 56 - 100°С, а время обработки -.10 120 мин. После гидролиза раствор нейтрализовали 10 М HCt,

Постановка реакции пассивной

гемагглютинации (РПГА), Для РПГА использовали 1%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов в ССР-БСА, Сыворотки перед исследованием прогревали 30 мин при 56с, Б качестве раст5 верителя применяли 0,1 М мединалвероналовый буфер (МВБ) рН 8,6. Реакцию ставили в полистироловых пластинах. В каждую лунку вносили по 50 мкл растворителя.. В первую лунку затем вносили 50 мкл сыворотки к гликолипияу и готовили двукратные разве дения. Затем в каждую лунку добавлял по 25 мкл взвеси эритроцитов,Пластины выдерживали 1 ч при комнатной температуре и затем определяли последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается гемагглютинация.

Постановка реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). В каждую лунку вносят по 25 мкл растворителя для РПГА. Затем в первую лунку вносят 25 мкл раствора гликолипида в концентрации 100 мкг/мл или исследуемого раствора до и после обработки щелочью и готовят двукратные разведения. После этого в каждую лунку добавляют по 25 мкл сыворотки к гликолипиду, разведенной в 2-4 раз меньше ее титра, и по 25 мкл 1%-ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Пластины выдерживают 1ч при комнатной температуре и затем определяют минимальную концентрацию гликолипида, тормозящую РПГА, а такж минимальную концентрацию исследуемого эндотоксина, вызывающую РТПГА. Предложенный способ по сравнению с известным обеспечивает повышение, специфической чувствительности.

Пример 1. Ингибирование РПГА различными ЛПС.

Результаты торможения РПГА различ ными ЛПС до и после их обработки щелочью (0,25 М NaOH, 5б°С, 1 ч)представлены в таблице.

Как видно из таблицы, различные ЛПС тормозили РПГА с гликолипидным диагностикумом в концентрациях,превышающих 2000 мкг/мл (дополнительные эксперименты показали,что для торможения необходима концентрация нативного ЛПС не менее 10мкр/мл) . Однако после щелочного гидролиза ингибирующая активность ЛПС резко

возрастала - минимальные ингибирующие концентрации колебались для различных препаратов ЛПС от 4 до . 50 мкг/мл.

После обработки щелочью ЛПС сохраняли способность тормозить РПГА с 0-антигенными эритроцитными диагностикумами, т.е. сохраняли CBOJo 0-специфичность (испытаны шигеллезные и сальмонеллезные диагностикумы и экспериментальные эшерихиозные диагностикумы, перекрестных реакций с нативными и гидролизованными ЛПС при этом не наблюдали). Таким образом, обработка щелочью приводит к раскрытию антигенных детерминант, распознаваемых антителами к гликолипиду . «

В РПГА с гликолипидным диагностикумом были испытаны также препараты ЛПС, выделенные из различных штаммо сальмонелл, шигелл и кишечной палочки методом экстрации хлороформом и метанолом. Приведенные эксперименты показали, что эти препараты также приобретали способность тормозить РПГА с гликолипидным диагностикумом лишь после щелочного гидролиза.

В экспериментах были испытаны также эритроцитарные сальмонеллезные и шигеллезные диагностикумы экспериментальные эшерихиозные 0-диагностикумы и сальмонеллезные, шигелг лозные и эшерихиозные диагностикумы сенсибилизированные препаратами ЛПС полученными методом хлороформ-метанольной экстракции. В РТП1А с этими диагностикумс1ми были испытаны сенсйтины, использованные для получения диагностикумов. В этих экспериментах РПГА тормозили только гомологичные сенситины независимо от их обработки щелочью.

Таким образом, способность выявлять в РТПГА липополисахариды различных бактерий после их щелочного гидролиза обладает только гликолипидный эритроцитарный диагностику и

Гликолипид

Шигеллы Зонне

1фазы

Шигеллы Зонне

2фазы

Эшерихия коли Эшерихия коли Эшерихия коли Эшерихия коли аиерихия коли Эшерихия коли

Сальмонеллы тмуриум

0,1

1

50 2000

15

2000

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами,сенсибилизированными гликолипидом из мутанта Salmonella minnesota R595 отличаю й( йен .тем, что, с целью повышения специфический чувствительности способа, исследуемые пробы предварительно обрабатывают 0,10-0,25 М раствором гидроокиси натрия при 56-100° С в т.ечение 10120 мин с последующей нейтрализацией раствором соляной кислоты.

Сальмонеллы тифа

2000

15

2000