ШТАММ БАКТЕРИЙ Shigella flexneri № 1605-8 СЕРОТИП 2a, ДЕПОНИРОВАННЫЙ В ФГУН ГИСК ИМ. Л.А.ТАРАСЕВИЧА ПОД НОМЕРОМ 285, СТАБИЛЬНЫЙ ПРОДУЦЕНТ S-ЛИПОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K39/112 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения липополисахарида (ЛПС) S.flexneri серотип 2а, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. Продуцируемый ЛПС должен обладать высокой O-специфичностью S.flexneri 2а и не реагировать с диагностическими моновалентными сыворотками к антителам других серотипов. В тексте заявки описаны морфологические и биохимические признаки штамма, его серологические и биологические свойства.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения липополисахарида (ЛПС) S.flexneri серотип 2а, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. Продуцируемый ЛПС должен обладать высокой O-специфичностью S.flexneri 2а и не реагировать с диагностическими моновалентными сыворотками к антителам других серотипов.

Целью изобретения является штамм №1605-8 S.flexneri серотип 2а, депонированный в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, стабильно продуцирующий S-ЛПС.

Штамм S.flexneri № 1605-8 серотип 2а, депонированный в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, был получен от больного тяжелой формой шигеллеза Флекснера в 1965 году и в настоящее время депонирован и хранится в коллекции ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича. В связи с разработкой вакцины против шигелл Флекснера авторами проводилось исследование качества вакцинного продуцента штамма № 1605-8 S.flexneri серотип 2а, депонированного в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, для коммерческого производства вакцин против дизентерии Флекснера. В связи с этим отсутствуют зарегистрированные штаммы-продуценты S.flexneri серотип 2а.

Морфологические признаки: мелкие неподвижные грамотрицательные палочки.

Культуральные признаки: штамм является факультативным анаэробом, хемоорганотрофом, обладающим дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 37°С. Растет на простых питательных средах, через 15±3 часа инкубации при температуре 37±1°С на мясо-пептонном агаре образует некрупные 2-265 мм в диаметре непигментированные полупрозрачные колонии с ровными краями (S-форма), могут встречаться (до 5%) мутные колонии с зубчатыми краями (R-форма), на мясо-пептонном бульоне через 4±1 часа происходит равномерное помутнение среды.

Биохимические признаки: не ферментирует сорбит, дульцит и сахарозу. Разлагает D-глюкозу, маннит, арабинозу, маннозу, трегалозу без образования газа. Медленно разлагает лактозу и мальтозу. Желатин и мочевину не гидролизует. В присутствии KCN не растет. Не продуцирует фенилаланиндезаминазу, дезоксирибонуклеазу и аргинингидролазу. Индол и сероводород не образует. Восстанавливает нитрат. Образует каталазу и орнитиндекарбоксилазу. Колонии непигментированные. Реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная. Проба с метиловым красным положительная. На среде Симмонса с цитратом не растет.

Серологические свойства: дает четкую положительную реакцию с сывороткой диагностической неадсорбированной к шигеллам Флекснера 1-5. Положительно реагирует с сывороткой диагностической шигеллезной адсорбированной к шигеллам Флекснера II типовой и с сывороткой диагностической шигеллезной адсорбированной к шигеллам Флекснера 3,4 групповой.

Биологические свойства: штамм №1605-8, депонированный в ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасовича под номером 285, обладает выраженной вирулентостью.

При введении в конъюнктивальный мешок морской свинки массой 200-250 г вызывает гнойный кератоконъюнктивит с последующим помутнением роговицы, 100%-ная летальная доза (ЛД₁₀₀) - не более 5 10⁷ микробных клеток.

При внутрибрюшинном введении мышам в минимальном 0,4% полужидком агаре 50%-ная летальная доза (ЛД₅₀) не более 2×10⁸ микробных клеток.

При введении в легкие мышей молодой (16-часовой) бульонной культуры ЛД₅₀ не превышает 1,5-2×10⁵ микробных клеток.

При пассировании на мясопептонном агаре (длительность пассажа 18 часов, температура 37°С) штамм стабильно сохраняет признаки S-формы. Содержание колоний в R-форме через 3 пассажа не превышает 10%.

Штамм хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4-10°С. Обязательный контроль всех свойств штамма проводят ежегодно. В промышленном применении штамм может быть использован для производства вакцины против шигелл Флекснера.

Пример 1. Пассирование штамма №1605-8 S.flexneri серотип 2а, депонированного в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, на плотной среде

Ампулу с лиофилизированной культурой стерильно вскрывали и вносили в нее стерильный физиологический раствор. Каплю полученной суспензии клеток стерильной пипеткой переносили на чашку Петри с мясопептонным агаром 1,5% и рассевали по всей поверхности чашки стерильным шпателем. Тем же шпателем делали посев еще на пять чашек с плотной питательной средой. Чашки помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С. Выросшую культуру смывали 1,5% мясо-пептонным бульоном и в течение 6 часов подращивали в колбах емкостью 200 мл, а затем пересевали в колбы емкостью 1 л. Выращивание проводили в течение 6 часов при 37°С. Количество S (прозрачных) колоний определяли прямым подсчетом в проходящем свете. Для каждого следующего пассажа в проходящем свете отбирали S-колонии, суспендировали биомассу в стерильном физиологическом растворе и с помощью стерильного шпателя рассевали по поверхности чашек с плотной питательной средой.

Для определения продуктивности штамма стандартным методом горячей водно-фенольной экстракции был выделен препарат ЛПС. Продуктивность штамма составила 3-7 мг ЛПС с 1 л культуры.

Пример 2. Иммунологическая активность и специфичность ЛПС S.flexneri серотип 2а, выделенного из штамма № 1605-8 S.flexneri серотип 2а, депонированного в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285

Активность определяли методом иммуноферментного анализа. На планшеты адсорбировали выделенные из исследуемого штамма препараты липополисахарида (образец № 1 и № 2). Различные (типовые, групповые) диагностические сыворотки S.flexneri титровали шагом 1/2 (чертеж). Наблюдали высокую иммунологическую активность образцов ЛПС S.flexneri 2а со специфическими сыворотками S.flexneri 2а типовой 3, 4, S.flexneri 2а групповой II, а также зарегистрировали отсутствие реакции с диагностической сывороткой S.flexneri 2b типовой 7, 8.

Пример 3. Подготовка образцов для проведения гельэлектрофореза (ГЭФ)

18-часовую культуру смывали с агара фосфатным буфером (рН 7,2), добавляли азид натрия до концентрации его в смыве 0,01% и оставляли при 4-10°С на 3 часа. После этого культуру, убитую азидом натрия, разбавляли до оптической плотности 0,4. Пробы по 1,5 мл помещали в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 1,5 минут. Надосадок удаляли, к осадку добавляли 50 мкл лизирующего буфера (2% додецилсульфата натрия, 4% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 1 М трис-HCl, рН 6,8). Образцы помещали в кипящую баню на 10 мин. После этого к каждому образцу лизата бактериальных клеток добавляли 10 мкл лизирующего буфера с 25 мкг протеиназы К (Sigma) и инкубировали 1 час при 60°С.

Пример 4. Проведение ГЭФ с последующим окрашиванием аммиачным раствором азотнокислого серебра

ГЭФ изучаемых препаратов проводили на приборе для электрофореза фирмы BioRad (Швеция) по Laemli [Laemli U.K. Cleavage of strucrural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P.680] в присутствии додецил-сульфата натрия. В работе использовали 3%-ный концентрирующий и 12,5%-ный разделяющий гели (толщина геля 0,8 мм). Объем образцов при нанесении составлял 5-10 мкл. Длина пробега образцов в разделяющем геле не превышала 15 см. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 15 мА, а в разделяющем - 30 мА. Окрашивание геля после проведения электрофореза осуществляли по методу Tsai [Tsai, C.-М., С.Е.Frasch. E. Rivera, H.D.Hochstein. Measurements of lipopolysaccharide (endotoxin) in meningococcal protein and polysaccharide preparations for vaccine usage. // J. Biol. Stand. - 1989. - V.14. - P.25].

Из данных ГЭФ следовало, что ЛПС S.flexneri штамм № 1605-8, депонированный в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, является типичным S-ЛПС, т.е. представляет собой популяцию полимерных молекул, включающих O-специфический полисахарид с различным количеством повторяющихся олигосахаридных звеньев. Кроме того, ГЭФ-анализ ЛПС, выделенных их бактериальных клеток, полученных в результате десяти пассажей культивирования, показал отсутствие изменений в картине ГЭФ и, следовательно, стабильность молекулярно-массового распределения ЛПС при пассировании штамма.

Источники информации

Laemli. U.K. Cleavage of strucrural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P.680.

Taylor DN, Trofa AC, Sadoff J, Chu C, Bryla D, Shiloach J, Cohen D, Ashkenazi S, Lerman Y, Egan W, Schneerson R, Robbins JB. Synthesis, characterization and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect Immun. 1993, Sep; 61 (9): 3678-87.

Tsai, C. - M., C.E.Frasch. E.Rivera, H.D.Hochstein. Measurements of lipopolysaccharide (endotoxin) in meningococcal protein and polysaccharide preparations for vaccine usage. // J. Biol. Stand. - 1989. - V.14. - P.25.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения липополисахарида (ЛПС). Штамм S.flexneri № 1605-8 серотип 2а получен от больного тяжелой формой шигелезом Флекснера и депонирован в ФГУН ГИСК им. Л.А.ТАРАСЕВИЧА под номером 285. Штамм пригоден для создания вакцинных и диагностических препаратов. Продуцируемый ЛПС обладает высокой O-специфичностью S.flexneri 2а и не реагирует с диагностическими моновалентными сыворотками к антителам других серотипов. 1 ил.

Штамм бактерий Shigella flexneri №1605-8 серотип 2а, депонированный в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 285, стабильный продуцент S-липополисахарида.