Способ хемотаксономической идентификации шигелл Флекснера и эшерихий Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для таксономической идентификации (семейственно-родовой и ви- дозой) атипичных и типичных представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности шигелл и эшерихий, а также их половых гибридов.

Цель изобретения - повышение точности за счет выявления половых гибридов шигелл и эшерихий и упрощение способа,

В качестве хемотаксономических маркеров используют особенности качественно-количественной характерис-.

ТИКИ жирнокислотного состава наиболее массивных и эволюционно значимых фосфолипидов энтеробактерий - фосфатидилэтаноламина ; дифосфатидилглице- рина и используют индикационно-диагностический коэффициент (ЮЩК) - К четн.жирных кислот, К биосинтеза ЦЖК (циклопропановых жирных кислот), К изомеров РЖК С,5-С,7 (разветвленных жирных кислот).

Пример 1. Генетическую родовую рекомбинацию проводят с использованием в качестве реципиента (F) - Sh.flexneri № 737 тип 2а, грамотри- цателен, неподвижен, дает потомство

в кроссе с фертш1ьноактивными эшери хиями (F ), устойчив к стрептомицин (Str ), чувствителен к антибиотикам мономицину и неомицину (mon, пео) лактозу не ферментирует (Lac), вирулентеп,ЬП5о для белых беспородных мшей составляет 110,47 млн микробных те

Донором служит (F) E.coli HfrH (7l) - грамотрицателен, в кроссах с реципиентом шигелл Флекснера дает высокую частоту генетических рекомбина тов, подвижен, перитрих, чувствителен к стрептомицину (Str5) устойчив к антибиотикам мономицину и неоми- дину (топ , ), обладает высокой ферментативной активностью в отношении лактозы (Lac ), не вирулентен (LDjo) . для беспородных- белых больше 10000 млн микробных тел.

Половые гибриды (генетические ре- комбинаты) шигелл Флекснера и эшери- кий представляют собой штаммы: R-737-2, R-737-4, R-737-6. Они имеют одинаковые биологические характерис- тики: грамотрицательны, неподвижны, устойчивы к стрептомицину, стрептомицину Str , иономицину топ , неомицину пес , отличаются активностью в отношении к лактозе. Последнее используют вместе со стрептомицин- резистентностью как важный селектив- ньй признак для отбора рекомбинантов |Это позволяет избежать влияния жир- нокислотного состава питательной |Среды на ростовые характеристики Штаммов и жирнокислотный состав андо |генных липидов. Наилучшим способом остгокения стабильности жирнокислот- 1НОГО состава бактерий служит их мно- |гократное пассажирование. В опытах с этой целью используют межродовую генетическую рекомбинацию. По виру- дентности половые гибриды следуют за реципиентной культурой: для белых беспородных мышей LP oсоставляет 133,47 млн микробных тел.

Биомассу бактериальных культур вырашивают на стандартных плотных средах МПА одной серии изготовления. Отмыв культуры от остатков среды про- изводят раствором натрийхлорида с массовой долей 0,50% до отрицатель- ной реакции с нингидридом.

Экстракцию клеточных липидов производят из убитой ацетоном и лио- филированной биомассы культур методом Фолча. Клеточные липиды хранят в смеси хлороформ - метанол в отно

JQ 15 0

5

0

5

шении 2/1 (V/V) в стеклянных пробир - ках с притертыми пробками при . Антиоксиданты не добавляют.

Липидную природу выделенных фракций подтверждают и с помощью инфракрасных спектров. Идентификацию полос поглощения в ИК-спектрах проводят известными методами. ИК-спектры образцов липидов определяют в диапазоне 400-4000 виде жидких пленок на подложке из калийбромида. Для идентификации классов фосфо- липидов применяют универсальные фосфорномолибденовьш реактив, специфические реактивы на функциональ- ные группы. В качестве стандартов используют коммерческие фосфолипи- ды. Фосфор в целых липидах и во фракциях определяют согласно руководству М.Кейтса. Для получения моноено- вых жирных кислот фосфатидилзтанол- амины подв ергают кислому метанолизу. Полученные экстракты очищают тонкослойной хроматографией -на силикаге- ле марки КСК в системе: петролейный- диэтиловый эфир, (V/V) 19:1. Качественно-количественную характеристику жирных кислот получают при использовании газожидкостной хроматографией при, условиях: стеклянная коло11ка 5 м X 1 мм, чувствительность 2ИО, температура колонки , испарителя н-ЗОО с, подвижная фаза 3% SP 1000, размер зерен 50-80 меш, в качестве внешних стандартов используют набор -жирных кислот.

Хроматомассоспектрометрию жирных кислот, ведут на масс-спектрометре, используя колонку с 3% Sp-10000 в изотермическом режиме (+220°С). - Спектроскопическое изучение жирных кислот производят методом 1ЯМР на высокочастотном ЯМР-спектрометре при следующих условиях: внутренний стандарт - гептаметилендисилоксан, растворитель - диейтерированный хлороформ, частота 80 МГц,температура +25°С, в интервале t-шкалы от -5 до +12,5 м.д.

Для всех изученных культур рассчитывают К четн. ЖК, К биосинтеза ЩК и К изомеров РЖК , Производят статистическую обработку цифровых данных.

Качественно-количественные характеристики зkиpнoкиcлoтнoгo состава фос- фатидилэтаноламинов генетичес -.их рекомбинатов приведены в табл. 1

5

и дифосфатидилглицерина генетических рекомбинатов и исходных культур - в табл. 2.

На основании особенностей жирно- кислотного состава фосфолипидов сое .тавлена табл. 3, суммирующая результаты вдентификации половых гибридов шигелл и эшерихий типичньк исходных культур. Различия в жирнокислотных показателях, определяемых в предлагаемом способе, позволяет достаточно надежно отдифференцировать природные аналоги генетических рекомби натов шигелл и эшерихий.

Использование предлагаемого способа хемотаксономической идентификации гибридов шигелл Флексуера и эшерихий и исходньк культур с использованием коэффициентов жирнокислотного состава ФЭ и ДФГ обеспечивает по сравнению с известными способами повышен- ную стабильность и эффективность хе- мотаксономических критериев, что достигается закреяпением. особенностей ЖК состава путем -генетической рекомбинации и введением дополнительных коэффициентов, учитывающих

Культур

- :: ± 1 1Т1 11° ::« : -ная ар 1ктери„„ л уТ

Качество жирных «нслот

т а в л н ц «

011196

биосинтетические особенности цикло- пропановых, моноеновых и изомеров разветвленньпс жирных кислот, поэтап- ную типизацию энтеробактерий и их гибрвдов, что достигается разработкой схемы типизации, а также надежность используемьк критериев, что достигается эволюционной значимос- ° и статически выявлен- ными достоверностями в уровнях изучаемых показателей.

15

Формула изобретения

Способ хемотаксономической идентификации шигелл Флекснера и эшерихий включающий вьщеление клинических ;- лятов, посев, культивирование и на- 20 копление бактериальной массы экстракцию клеточных липвдов и иденти- Фикацию бактерий по фосфолипвдному и жироокислотному составу клеточных липидов, о т л и ч а ю щ и и с я SM, 25 что, с целью повьштения точности способа, дополнительно выявляют наличие половых гибридов Флекснера по составу Фосфатидилэтаноламинов и дифосфати- дилглицерина.. .

т а в л н ц « I

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для таксономической идентификации /семейственно-родовой и видовой/ семейства ENTEROBACTERIACLAE, вч шигеля и эшерихий и их половых гибридов. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления половых гибридов шигеля и эшерихий и упрощение способа. Способ заключается в том, что из изучаемых клеток бактерий выделяют клеточные фосфолипиды, осуществляют их фракционирование, определяют содержание фосфатидилэтаноламина и дифосфатидилглицерина и используют индикационно-диагностический коэффициент /КИДК/-K четности жирных кислот, K биосинтеза циклопропановых жирных кислот, K изомеров разветвленных жирных кислот. K четности ЖК=четн.ИСК/нечет.ЖК

K биосинтеза ЦЖК=C_16:1+C_17:0/C_18:1+C_19:0

K изомеров РЖК=IC_15:0/IC_17:0+AC_17:0

Мокос- новые

Разветвленные

Шнсло- пропаЕ.соИ HfrH

(донор) .

Sh.flexneri

737 тип 2а

(реципиент)

Генетические

рскомОшитм

Приме

80,50 0,00

35,20 26,30 Ь.ЗО 3,00

3,50 -и,20 ),80

11,00

3,20

5,10 13,30 6,50 26,30

0,00 0,00

24,30 15,30 21,108,20

3,5

1,6 2,5

1,00

2,60 0,80

3,34

4,46 1,35

™р- Лр1::::: т-т-::::: . --- - предеТеи.--

по«..ат.е., с ированы .ре.ие Г и -% ТП:,.

3,5

1,6 2,5

1,00

2,60 0,80

3,34

4,46 1,35

-- - предеТеи.--

Таблиц

Таблица 3