Способ моделирования дыхательной вспышки полиморфоядерных лейкоцитов Советский патент 1991 года по МПК G09B23/28 G01N33/68 

1

(21)4497980/14 (22)25.10.88 (46)23.04.91. Бюл. № 15

(71)Институт химической физики АН СССР

(72)А.Р.Монастырская, В.М.Фролова, В.В.Роговин, В.И.Дейгин, А.П.Востряков

и В.А,Горбатов (53)612.015(088.8)

(56)Smith R.J., Wierenza W.. Iden S.S. Inflammation, 1980, v. 4, p. 73.

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ВСПЫШКИ ПОЛИМОРФО- ЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ

(57)Изобретение относится к фармакологии и биохимии и может быть использовано для моделирования дыхательной вспышки по- лиморфоядерных лейкоцитов. Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций. Предло- состоит в том, что при моделировании дыхательной сспышки в качестве источника лейкоцитоз используют цельную кровь, а регистрацию люммнол-за- виснмой хемилюминесценции проводят в присутствии пептидов тирозил-О-аланил- глицил-фенилаланил-лейиип-аргинина , L-глутамил L-три-п-оФана , М-ацетил-глюкозаминил-М-ацотил-мура- мил-1 -аланил-0-мзоглутам ,.1на -1Q М или аргинил-лизил-птутамил-вамил-тиро- зил-аргинина М. Изобретение позволяет упростить способ за счет сокращения операций по обработке крови и использования доступных препаратов. 1 .

Изобретение относится к фармакологии и биохимии и может быть использовано для моделирования дыхательной вспышки по- лиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯЛ).

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

В цельную кровь, разбавленную Физиологическим раствором в соотношении 1:9, добавляют следующие пептидные препараты: даларгин (тироэил-О-аланил-глицил-фе- нилаяанил-лейцил-аргинин) в концентрации

М, тимоген (1-глутамид-1-трипто- фан) в концентрации 10 -10 М, гликопептид (Ч-ацетил-глюкозаминил-М-ацетил-мурамил- и-алаиил-О-изоглутамин) в концентрации М, гексапептид (аргинил-лизил-глу- тамил-валил-тирозил-эргинин) в концентрации 10 М, используя всякли раз свежеприготовленный раствор.

Разведения и последующие измерения проводят в полистиреновых кюветах, что исключает возможность прилипания пептидов к стенкам сосудов, увеличивает точность измерения.

Максимальные значения хемилюминес- ценции цельной крови определяют в спокойном состоянии лейкоцитов и после индукции фагоцитоза добавлением полисти- ренового латекса диаметром 0,82 мкм (4 10 на кювету). Измерения проводят на люмино- метре. Для усиления хемилюминесценции (ХЛ) используют люминол (5-аиио-2,3 дигпд- ро-1,4-фталазиндион, Серва), предварительно разведенный в физиологическом растворе с добавкой триэтаноломп.-а в концентрации 9 мкм/мл. Конечная концентрация люминола в кювете составляет М.

Регистрируют интегрированный сигнал ХЛ за 10 с в сериях опытов со спонтанной и индуцированной фагоцитозом ХЛ при добавлении в кюветы растворов пептидных препаратов изученных концентраций, Измерения проводят в трипликатах образцов. Результаты измерений анализируют по максимальным значениям интегрированного сигнала в сериях экспериментов по каждой концентрации каждого пептидного препарата (ХЛэксп) и в контрольных образцах, куда добавляют эквивалентное количество физиологического раствора без пептида (ХЛ контр.). Затем вычисляют изменения ХЛ ХЛэксп. - ХЛконтр. при всех изученных концентрациях взятых для изучения пептидных препаратов в покое и при фагоцитозе.

П р и м е р. В цельную кровь 20 белых мышей, беспородных самцов весом 18-20 г, половозрелых, предварительно собранную в общую гепаринизированную емкость и затем помещенную в полистиреновые кюветы с физиологическим раствором в соотношении 1:9, добавляют тимоген в концентрации М.

Для измерения ХЛ используют 4 трип- ликата образцов: с концентрацией тимогена М в кювете с латексом для фагоцитоза, с концентрацией тимогена М в кювете с физиологическим раствором, с цельной кровью без тимогена с латексом для фагоцитоза и с цельной кровью без тимогена и без латекса с физиологическим раствором. Измерения в таких трипликатах проводят одновременно после одновременной инкубации в течение 10 мин при 37°С. Измерения фиксируют один раз в 10 мин до резкого уменьшения интенсивности ХЛ и отбирают максимальный результат.

Это и есть максимальный показатель интегрированного сигнала ХЛ за 10 с. Одно- временно измеряют фоновую ХЛ, для чего перед началом измерений образуов измеряют ХЛ пустой (бланковой) кюветы, значение которой в дальнейших измерениях автоматически вычитается из измеренных значений ХЛ изучаемых образцов.

После подготовки образцов к измерению (помещение в кюветы цельной чрови с физиологическим раствором 1:9, добавление тцмогена М в кювету или аналогичного объема физиологического раствора), заполняют диспенсер латексом и отдельно физиологическим раствором, затем добавляют во все, кроме бланковой кюветы, лю- минол в концентрации М в кювете и инкубируют образцы 10 мин при 37°С. Затем измеряют ХЛ всех образцов, с помощью диспенсеров добавляют латекс по 4 10 на кювету или соответственно тот же объем физиологического раствора в те образцы,

куда не следует добавлять латекс. Записывают значения ХЛ, индуцированной латексом (при фагоцитозе), и неиндуцированной в кюветах, где нет латекса.

Запись значений продолжается до достижения низких значений ХЛ (в течение часа).

Величина прироста ХЛ составляет 262%.

Описанным способом проведены измерения уровня ХЛ и при других концентрациях тимогена, пептида и других.

Данные представлены в таблице. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает в сравнении с известным упрощение за счетсокращения числа трудоемких операций по обработке крови путем использования цельной крови и замены дорогостоящего импортного пептидного фактора значительно более дешевыми

пептидными препаратами при одновременном повышении специфичности способа, так как применение впервые пептидного фактора после добавления корпускулярного стимула обнаружило добавочный однонаправленный эффект от применения обоих стимулов, что позволяет усилить ХЛ при добавлении корпускулярного стимула, при надобности по ходу эксперимента, дополнительно усилить ХЛ внесением растворимого стимула из числа предложенных пептидных факторов.

Формула изобретения Способ моделирования дыхательной

вспышки полиморфоядерных лейкоцитов путем обработки полиморфоядерных лейкоцитов активаторами дыхательной вспышки и пептидными факторами с последующей регистрацией интенсивности дыхательной вспышки по уровню лю- минол-зависимой хемилюминесценции, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве источника полиморфоядерных лейкоцитов используют

цельную кровь, а в качестве пептидных факторов - тирозил-О-аланил-глицил-фенилалил- лейцил-аргинин в концентрации Ц. Ь-глутамил-Ьтриптофан в концентрации - ЮМ, М-ацетил-глюкозаминил-М-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин 6 концентрации 10 10-10 s М или аргинил- лизил-глутамил-валил-тирозил-аргинин в концентрации 10 11-10 5 М.