Способ получения -сульфоната в-цепи инсулина человека Советский патент 1979 года по МПК C07K14/62 C07K1/06 

.(54) СПОСОБ ПОЛУЧ.ЕНИЯ S, S -СУЛЬФОНАТА В-ЦЕПИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

Целью изобретения HB.rtHefcH повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения S,S -сульфоната В-цепи инсулина человека путем конденсации низших защищенных пептидов, Частичного удаления защитн групп, заключительной конденсации полученных пептидных фрагментов, полного удаления защитных групп и окислительного сульфитолиза, заключающегося в том, что в качестве низших защищенных фрагментов используют пептиды последовательности 9-15: трёт-бутилоксикарбонил-гидразид, карбобенэокси-серил-гистидил-лейцил-валил-1Г-трет-бутил-глутамил -аланил-лёйцина и 16-20: о-нитрофенилсульфенил-6-бензил-тирозил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цистеинил-глицкн;заключительную стадию конденсации проводят с пептидом последовательное ти 1-15: бис-трет- бутилоксикарбонил-гидразид бис-(карбобензокси-фенилаланил- валил-аспарагинил-глутамйнилгистидил-лейцил)-цистеинил-бис-(глицил-серИл-гистидил-лейцил-валил-трет-бутил-глутамиЛ-алйнил-лейцина) и пептидом последовательности 16-30: о-нитрофенилсульфенил -О-бензил-

-тирозил-лейцил-валил-3-аце амидометил-цистеинил-глицил-З -трет-бутил-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил- -трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонином.

Использование описываемого способ конденс ации фрагментов последовательности 1-15 и 16-30 позволяет получит целевой продукт свыходом 40%; Пример 1.

а. бис-(Карбобензокси-фенилаланил .-валил-аспаргил-глутамил-гистидил-лейцил)-цистинил-бис-(глицил-О-трет-бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валилУ-Т-трет-бутиловыйэфир-глутамил-аланил-трет-бутилоксикарбонил-гидразид,

0,120 г карбобензокси-о-трет-бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валил-2Г-трет-бутиловый эфир-глутамил-аланил-трет-бутил-оксикарбонил-гидразида суспендируют в 5 мл метанола и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение двух дней. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре водой и метанолом, фильтрат упаривают досуха, растворяют остаток в 2 мл гексаметанола,добавляют к раствору 0,120 г бис-(карбобензокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутамил-гистидил-лейцил).-цистеинил-бис-глицйна и 0,031 г

дициклогексилкарбодиимила, выдержи вают-два дня при О С и два дня при комнатной температуре.Отфильтровываю дициклогексилмочевину, разбавляют фильтра эфиром, отфильтровывают

выпавший осадок, промывают его на фильтре смесью метанол - эФио сушат и получают 0,125 г продукта, содержащего 1,2 (1) цистеина, 1,8 (2) гистидина,.0,7 (1) аспарагиновой кислоты, 0,4 (1) серина, 1,0 (1) глицина, 1,5 (2) глутаминовой кислоты, 1,7 (2) валина, 0,6 (1).фенилаланина, 1,8 (2) лейцина, 0,7 (1) аланина.

Здесь и далее в скобках указано теоретическое количество аминокислот.

б . бис- (о-Нитрофенилсульфенил) -бис-(глицил-Т-трет-бутиловый эфир-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил- пролил-g-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треон

К раствору 1,0 г бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцил-тирозил-лейцил-валил)-цистеинил-бис-глицина и 0,2 г п-нитрофенола в 15 мл диметилформамида при -1б°с добавляют 0,3 г дициклогексилмочевины, разбавляют фильтрат водой, экстрагируют этилацетатом, сушат и упаривают экстракт досуха. После кристаллизации остатка из смеси изопропйловый спирт-гексан получают 0,6 г (50%) продукта, т.пл. 270°С (разл) .J ° -22(, диметилформамид). ...

Найдено, %: С 54,39; ri 6,73; Cg,H, ,,4S4. Вычислено,%: С 54,39; F 6,00. 0,9 г карбобензокси-9 трет-бути-. ловый эфир-глутамил-а{)гинил-глицил фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил- -трет-бутилоксикарб онил-лизил-треонина растворяют в 10 мл метанола,добавляют 5,36 мл 0,10 н.серной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение трех дней. Катализатор отфильтровывают, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в 50%-ном метаноле и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит ИРА-410 (ОН-форма). Смолу отфильтровывают, промьшают-на фильтре 50%ным метанолом, упаривают фильтрат досуха, сушат остаток в вакууме над пятиокисью фосфора и растворяют в 4 мл диметилформамида. К полученному раствору добавляют, 0,4 г продукта, полученного выше, выдерживают один день при комнатной температуре, разбавляют эфиром,.отделяют осадок центрифугированием, кристаллизуют из метанола и получают 0,7 г (77%) продукта, т.пл. 174-178°C; cCj -26 (cel, диметилформамид) .. Найдено, %: С 56,89; Н . Вычислено,: С 56,92; Н 6,85. в. S,s-Дисульфонат В-цепи 50 мг продукта, полученного на стадии а, растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 ч при комнатной температуре, упаривают досуха, разбавляют остаток водой и снова упаривают досуха. Эту операцию -повторяют еще три раза. Остаток после упаривания растворяют в.10 мл диметилформамида, добавляют 0,07 мл 2,00 н.раствора НС1 в тетрагидрофур не, при -20°С добавляют 0,1 мл раст вора, содержащего 1,9 мг нитрита натрия, вьщерживают 30 мин при -20° охлаждают полученный азид до-40°С и нейтрализуют триэтиламином. 62 мг продукта, полученного на стадии , растворяют в 5 мл мет нола, охлаждают до 0°С и добавляют 0., 1 мл уксусной кислоты и -0,1-МЛ 0,3 н.раствора НС1 в мета;ноле.. Чере 10 мин смесь упаривают досуха, раст ряют остаток в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит ЙРА-.41 (ОН-форма). Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре, водой, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в минимальном количестве ди метилформамида и при -40°С добавляют к раствору, содержащему азид. Полученную смесь выдерживают три дн при -5°С и два дня при комнатной температуре, упаривают досуха, оста ток растворяют в 30 мл трифторуксус ной кислоты и в течение 2 ч пропускают через раствор сухой водород. Раствор упаривают досуха при комнатной температуре, сушат ос таток в вакууме над твердой щелочью и пятиокисью фосфора, растворяют в 10 мл диоксана и 6 мл 0,2 н.трис-буфера (рН 8,1). К полученному рас вору добавляют 110 мг сульфита натрия и 60 мг тетратионата натрия, выдерживают 12 ч при комнатной температуре и 2 ч при 37°С, диализируют 6 ч против нескольких смен дистиллированной воды, раствор после диали за упаривают до наибольшего объема и лиофилизуют. Получают 12 мг (13%) продукта , -95 ± 5 (,1. 0,5 н.уксусная кислота). . Аминокислотный авали3-: лизин 1,15 (1),гистидин 1,92 (2), аргинин 0,92 (1), аспарагиновая кислота 1,05 (1), треонин 1,94 (2), серин 0,97 (1),глу таминовая кислота 3,18 (3), пролин 1,10 (1.), глицин 3,0 (3),.аланин 1.,0 (1), цистеин 1,59 (2)., валин 2,85 (3), лейцин 3,77 (4), тирозин 1,85 (2), фенилаланин 2,72 (3). Электрофорез проводят на бумаге при напряжении 1000-1200 В и экспозиции 50-60 мин в 2%-ной уксусной, кислоте, проявляя бензидином и хлором, и в буферном растворе, содержащем 4 М мочевину, муравьиную кислоту (13:2), проявляя реактивом Паули. Во всех случаях продукт был индивидуальным, его подвижность совпадала с подвижностью бис-сульфоната В-цепи инсулина быка, вьщеленного из природного инсулина и использованного в качестве свидетеля. Пример2. бис-трет- Бутилоксикарбонил-гидразид бис-(карбобензокси-фенилаланил- . -валил-аспарагинил-глутаминил-гистидил-лейцил)-цистеинил-бис-(глнцил серил-гистидил-лейцил-валил-ЗГ-трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина) (Г). 1,6 г бис-(карбобензокси-фенилала нил-валил-аспарагинил-глутаминил-гистидил-лейцйл)-цистеинил-бис-глицина растворяют в 15 мл диметилформамида и добавляют продукт, полученный после гидрирования 1,65 г трет-бутилоксикарбонил-гидразида карбобензокси-сеоип-гистидил-лейцил-валил-у-трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина. Раствор охлаждают до и при перемешивании добавляют 2,1 г п-нитрофенола и 0,45 г дициклогексилкарбодиимида, Смесь выдерживают в течение трех дней при комнатной температуре, выпавише кристаллы отфильтровывают, фильтрат разбавляют О,5н. серной кислотой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают 2,5 г (88%) продукта. Аминокислотный состав: гистидин 2,16 (2), аспарагиновая кислота 1,09 (1), серин 0,67 (1), глутаминовая кислота 2,00 (2), глицин 1,17 (1), аланин 0,89 (1), цистеин 1,08 (1), валин 1,68 (2), лейцин 3,10.(3), фенилаланин 0,85 (1), о-Нитрофенилсульфенил-О-бен з илтирозил-лейцил-валил-З-ацетамидометил-цистеинил-глицил-у-трет-бутилглутамил-глицил-фенилаланил-феиилаланил-тирозил-треонил-пролил- -трет-бутилоксикарбЪнил-лизил-треонин (П),. 2,02 г о-нитрофенилсульфенил-О-бензил-тирозил-лейцил-валил-З-ацетамидометил-цистеинил-глицина растворяют в 30 -мл диметилформамида, добавляют 0,325 мл триэтиламина, смесь охлаждают до -10 С и добавляют продукт, полученный после гидрирования 3,58 г карбобензокси-у-трет-бутил-глутамил-аргинил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил- -трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонина. Смесь выдерживают в течение 30 мин при -10°С и затем еще в течение суток при 0°С, разбавляют 0,5 н.серной кислотой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат и получают 4,38 г (82%) продукта -19°(с 2, диметилформамид). Аминокислотный состав: лизин 0,96 (1), аргинин 0,89 (1) треонин 1,73 (2), глутаминовая кислота 1,00 (1), пролин 1,04 (1), глиин 2,08 (2), валин 1,17 (1), лейцин ,03 (1), тирозин 1,89 (2), фенилланин 1,84 (2). 3,3-сульфонат В-цепи инсулина еловека. а.0,260 г продукта И растворяют 5 мл диметилформамида и добавляют ,60 МП уксусной кислоты и tiGCicojibco апель метанола. К получони-му p.jirr-