Способ получения декапептида в-цепи инсулина человека последовательности 21-30 Советский патент 1976 года по МПК C07K7/06 C07K14/62 

Изобретение огноситсзг к усовершенствованию способа получения декапептида В, ,„

инсули1-1а человека. Эхо соединение может быть использовано при синтезе как природных инсулинов, так и их аналогов

Известен способ пол -ченйн дежапептида В а .,, инсулина, заключающийся в том. что известными методами проводят после- довательное наращивание пептидной депн с С-конда конденсацией соответственно защи-с щенных по аминогруппам в карбоксильным группам аминокислот, причем в качестве защиты группы используют тозйльную защиту с последующим удалением защитных груп натрием в жидком аммиаке,

Недостатками такого способа являются использование тозильной защиты для блокирования гуанидиногруппы аргйнина и « аминогруппы лизина, которая удаляется в жестких условиях, приводнщнх к деструкции молекулы: обработка натрием в жидком аь миаке либо насыщенным раствором бромис- того водорода в ледяной уксусной кнспоте при 70°С.

устракйюгся йс

iii-ЗО

K,

нижеуказанных ГЕПтиаа s амикогоЕСк-О -, а тйжже. жарбобензоЕСИгрушхы для зекшч-ь: гу анадЕйвгрулШы и тр&То б п Ело.асикарбональной гругяхь; кля аащв;ть5 с -амкяогру шЫ; удаление которых не деструкдвн пек- Тйдкой цеди.

Ярадгайгаегся способ пояучения декапептй- да В-деш1 инсулина человека псследозатель нооти 21--ЗО гсондексадкег ; ге;атапе:.гд-идй фе-нилaJШ.нйЛf--фeнклaялнй KE иpoзй:л Tpeoнил -rIJЮ™ пид™треТе«6утялоксихарбон 5дашзЕй трвоний-«Jipq isH трег -бут;- локскзшрбониплнзшг реоня на с карбобензоксиглипином и трикарбобех зоксйаргиш ном или трикарбобензоксзаргк ниягяидиноМг И С кгрет - буткл-озым эфа™ ром карбобензоксиглутамкновой кнслотк с послеодющЕМ сгштйвм защиты каташяческнм гидрогенолизом и выделекием целевого irtpoдукта известаым сяособома

Пример 1. Карбобекзокск -глицвл феннлала.нил --фенилаланил--тирозигг-Треонйг « цролш1- треТв утйЛОкс0Еа-р6-экня}шзиг тре я0н {| ййгк-г 1), Sp г карбобензоксифенилаланил-фенилала нил-тирозил-треонил- пролил- грет.-бутилокси харбониллизил-треонина растворяют в 4О мл метанола и гидрируют в присутствии 0,3 г палладия на угле до прекращения выделения углекислого газа. Катализатор отфильтровы вают, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют д 3,95 мл 1Д1 н. едкого натра и к по огченному раствору при перемеши вании добавляют 1,8 г п-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина в 30 мл диметилформамида. Смесь вьщерживают три дня при комнат ной температуре, охлаждают до О°С и обра батывают О,5 п. серной кислотой. Выпавши осадок отфильтровьшают, промывают нафиль тре водой и сушат. После кристаллизадии из смеси метанол-эфир получают 4,7 г (89 продукта, Т.Ш1. 142-145° С. (С 1, ДМФА;. Найдено,%: С 60,15; Н 6,79. Н оВычислено,%: С 60,43; Н 6,73. Трикарбобензокси-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролилтрет.-бутилоксикарбониллизил-а-реонин (продукт Н ). Остаток, полученный после гидрирования (см, предыдущую методику) 1,6 г продукта 1, растворяют в смеси 3 мл диметилформа- МИДа и 0,2 мл триэтиламина, к полученному раствору добавляют 1,О г п-нитрофенилового эфира трикарбобензоксиаргинина в 9 мл днметилформамида. Смесь оставляют на три дня при комнатной температуре, охлаждак г до О С и разбавлят 0,5 н. серной кислотой. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой и сушат. После кристаллизации из смеси метанол-эфир по- лучаю-т 1,8 г (77%) продукта, т. пл. 185187°С. - 24° (с 1, ДМФА). Найдено, %: С 61,22; Н 6,50. .OeiВычислено,%: С 61,58; Н 6,41. Карбобензокси- у .-бутиловый эфир-глутамил-аргинил-глицилфенилаланил-фени; аланил-тирозил-треонил- пролил-трет.-бути- локсикарбониллизил-треонин. 0,77 г продукта ц растворяют в 1О мл метанола, к полученному раствору добавляют 0,45 мл 1,0 н. серной кислоты и 0,3 г пал ладия на угле и гидрируют три дня. Катализатор отфильтровыва1 от, фильтрат разбавляют водой (10 мл) и обрабатывают ионообменно смолой Амберлит ИРА-410 (ОН-форма;. Затем смолу отфильтровывают, промывают на фильтре водой до отрипательной нингидринной реакции фильтрата, фильтрат упаривают досуха и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора, Остаток растворяют в 5 мл диметилформамида и добавляю-т О,3 г п-нитрсфе- нилового эфира } -трет-бутипового эфира карбобензоксиглутаминовой кислоты. Смесь выдерживают два дня при комнатной температуре, разбавляют абсолютным эфиром, выпавший осадок отфильтровьгоают, промывают этилацетатом и сушат. После кристаллизагции из смеси метанол-эфир получают 0,5 7 г (80%) продукта, т. пл. 168-170°а Е 37° (с 1, ДМФА). Найдено,%: С 58,15; Н 7,О8. Вычислено,%: С 58,15; Н 7,06. Аминокислотный состав (в скобках даны теоретические величины): глицин 1,3 (1 ), глутаминовая кислота 1,0 (1), треонин 1,9 (2), лизин и аргинин 2,3 (2), тирозин 0,7 (1), фенилаланин. Пример 2. Трикарбобензокси-аргинил-глицин. 1Д8 г п-нитрофенилоБого эфира трикар- бобензокси-аргинина и 0,25 г глицина с 0,28 г бикарбоната натрия растворяют в смеси 5 мл воды и 1О мл диоксана, полученную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, разбавляют 2 н. соляной кислотой, выпавшие кристаллы отфильт ровывают и промьтают на фильтре водой. После двукратной кристаллизации из этанола получают 0,97 г (91%) продукта, т.пл. 53-156°C.EcL ° + 7 (с 1, ДМФА). Найдено,%: С 6О,58; Н 5,58. зЛ С 60,65; Н 5,56. Вычислено, п-Нитрофениловый эфир трикарбобензокси-аргинил-глицина. 2,3 г трикарбобензокси-аргинил-глицина и 0,6 г п-нитрофенола растворяют в 1О мл тетрагидрофурана, охлаждают до -5°С и добавляют 0,9 г дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, вьшавшую дициклогексилмочевину отфильтровьшают, фильтрат упаривают досуха и остаток кристаллизуют из ацетонитрила. Получают 1,9 г (67%) продукта, т.пл. 188-191°С. (с 1, ДМФА). Найдено, %: С 6О,58; Н 5,58. Вычислено,%: С 60,71; Н 5,52. Трикарбобензокси-аргинил-глицил-фениппанип-фенилапанип-тирозип-треонил-пролилтрет.-бутилоксикарбониплизип-треонин. О,37 г карбобензокси-фенилалани; -фенилаани№-тирозил-треонил-пропил-трет.-бутилокикарбониллизил-треонина растворяют в 10 мл мефанола и ги/фируют в присутствии О,1 г пал ладия на угле. Катализатор отфильтровьшают, фильтрат упаривают досуха и остаток paciv воряют в О,ЗО мл 1,11 н, едкого натра. К полученному раствору добавляют О,3 г п-нитрофенилового эфира трикарбобензокси- ргинил-глицина в 5 мл диметилформами;. Смесь оставляют на два дня при комнатной температуре разбавляют 0,5 н. серной кислотой, выпавшие кристаллы отфильтровьта ют, промьшают водой и сушат. После кристаллизации из смеси метано; -эфир получают 0,39 г (73%) продукта, т, пл. 183- 186°С. - 0 (с 1, ДМФА). Найдено, С 61,54; Н 5,96. Л,,О,,, :ij5 io5 ... . Вычислено,%: С 61,58; Н 6,41. Следующую схадню проводят так же, как в примере 1. Формула изобретения Способ получения декапептида В-депи инсулина человека последовательности 21ЗО конденсацией низшего пешгида с заши шенными аминокислотами известным способом, удалением защитных групп и выделением целевого продукта известным способом отличающийся тем, что, с целью усовершенствования технологического процесса, в качестве низшего пепти; используют гептапептид фенилаланил-фенилалaнил-тиpoзил- rpeoни -пpoлил-тpeт.- yтилoк- сикарбониллизил-треонина, который конденсируют с карбобензоксиглицином и трикарбобензоксиаргинином или трикарбобензокси- аргинилглицином, и с у -трет.-бутиловым эфиром карбобензоксиглугаминовой кислоты и заш:итные группы у/иляют каталитическим ги/фогенолизом.