Защитная среда для лиофильного высушивания облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состоянии.

Цель изобретения - повышение выхода жизнеспособных микробных клеток.

Защитную среду готовят следующим образом.

Для обеспечения содержания в среде белка молока 1,8-5,6 г/л берут 150-400 мл обрата или 3,0-8,0 г сухого порошкового молока и доводят бидистиллированной водой до 500 мл. Раствор сухого порошкового молока обезжиривают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды растворяют 73-91 г трис-основания и доводят до рН 6,4 соляной кислотой плотностью

1,18 г/см3, затем в полученном буфере растворяют 73-137 г многоатомного спирта и оба раствора раздельно автоклавируют при . 0,6 атм 45-50 мин. После остывания растворы асептически смешивают в стерильном мерном стакане и доводят до 1 л стерильной бидистиллированной водой. Бактериальную массу получают на плотных или в жидких питательных средах. Анаэробные бактерии выращивают при 37°С в атмосфере 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа. Защитной средой бактерии смывают с поверхности плотной питательной среды или ресуспёндируют в среде осадки бульонных культур микроорганизмов до конечной концентрации 10 -1011 бактерий в одной пробе (1650-300 мкл). Манипуляции с облигатно анаэробными бактериями произО

ел го со со

I

водят в токе газовой смеси для выращивания анаэробных бактерий. Суспензии микроорганизмов вносят в стеклянную ампулу или другой подходящий сосуд и замораживают в смеси этанол - твердая углекислота в течение 15-20 мин. Замороженные пробы помещают в холодную (минус 20°С и ниже) камеру под вакуум 0,01-0,005 атм на 12-18 ч. По окончании высушивания проба содержит не более 0,5-3,0% исходного количества воды. После запитывания ампул под вакуумом культуры пригодны для длительного хранения (1-2 года и более) при 0-4°С без релиофилизации.

П р и м е р 1. Берут белок молока 3,7 г, для чего 275 мл обрата доводят до 500 мл бидистиллированной водой. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 82 г трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см готовят трис-солянокислый буфер с рН 6,4, в котором растворяют 96 г адонита. Растворы автоклавируют раздельно при 0,6 атм 45-50 мин. После остывания растворы асептически сливают в стерильном мерном стакане и доводят объем до 1 л стерильной бидистиллированной водой. Полученным раствором смывают с плотных питательных сред культуры микроорганизмов так, чтобы в 150-300 мкл суспензии содержалось не менее 109-1011 бактерий. Из полученной суспензии готовят 10-кратные разведения в свежерегенерированном цистеин-рингеровском растворе и высевают на соответствующие плотные питательные среды для определения количества живых клеток до лиофилизации. Остальное количество суспензии распределяют по 100-300 мкл в стеклянные ампулы, взвешивают для определения среднего веса ампул для каждой культуры и замораживают ампулы в смеси этанол - твердая углекислота в течение 20 мин. Замороженные пробы помещают под вакуум 0,01-0,005 атм при минус 20°С и ниже на 16 ч. Высушенные ампулы взвешивают вновь, определяя остаточную влажность как разность между средним весом ампул до лиофилизации и после нее. Ампулы запаивают под вакуумом и хранят при . Остаточная влажность проб не превышает 0,5-3,0%. Результаты представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Берут белок молока 1,8 г, для чего 3,0 г сухого порошкового молока разводят в 500 мл бидистиллированной воды и центрифугируют при 5000 д, затем удаляют скопившийся сверху жир, сохраняя водяную фазу. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 73 г трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см3 готовят трис-солянокислый буфер с

рН 6,4, в котором растворяют 73 г маннита. Оба раствора стерилизуют раздельно при 0,6 атм в течение 50 мин. Далее все манипуляции осуществляют согласно примеру 1. Остаточная влажность проб при этом не превышает 0,5-3,0%.

П р и м е р 3. Берут белок молока 5,6 г, для чего 400 мл обрата доводят бидистиллированной водой до 500 мл. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 91 г трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см готовят трис-солянокислый буфер с рН 6,4, в котором растворяют 137 г

сорбита. Оба раствора стерилизуют раздельно при 0,6 атм 45 мин. Далее все манипуляции осуществляют согласно примеру 1. В указанных условиях выживаемость культур отличается от значений по примеру 1 не

более чем в 10 раз для каждой высушенной культуры соответственно. Остаточная влажность проб не превышает 0,5-0,3%.

В табл.1 показан видовой спектр обли- гатно анаэробных и микроаэрофильных бактерий.лиофильно высушенных в предлагаемой защитной среде.

В табл.2 показано влияние состава защитной среды на выживаемость анаэробных и микроаэрофильных бактерий после 12

мес хранения при 0-4°С в вакууме.

Из полученных данных следует, что защитная среда превосходит известные среды по сохранности лиофилизированных

культур облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов, допускает хранение проб под вакуумом при 0-4°С в течение длительного времени без существенного снижения выживаемости бактерий,

позволяет упростить процедуру хранения без утраты лиофилизированных культур при небольших сроках хранения (от 2 мес до 1 г.), а также обеспечивает хорошую сохранность микроорганизмов различных таксономических групп, включая облигатно анаэробные бактерии.

Формула изобретения

1. Защитная среда для лиофильного высушивания облигатно анаэробных и

микроаэрофильных микроорганизмов, содержащая белок молока и бидистиллиро- ванную воду, отличающаяся тем, что. с целью повышения выхода жизнеспособных микробных клеток, она дополнительно

содержит трис-солянокислый буфер с рН 6,4 и многоатомный спирт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Белок молока1,8-5,6

Трис-солянокиг.лый

2. Среда по п.1,отличающаяся тем,

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состоянии. Цель изобретения - повышение выхода жизнеспособных микробных клеток. Среда содержит, г/л: белок молока 1,8-5,5; трис-солянокислый буфер с рН 6,4 73-91: многоатомный спирт 61-137; бидистиллированная вода до 1 л. В качестве источника белка молока среда содержит жидкое или сухое порошковое молоко, подвергнутое обезжириванию центрифугированием, а в качестве многоатомного спирта - адонит, сорбит или маннит. Среда обладает универсальностью, так как позволяет длительно сохранять в лиофилизированном состоянии микробные клетки независимо от их биохимических особенностей. Допускается хранение лиофилизированных культур без вакуума при комнатной температуре или при высокой остаточной влажности, хотя наилучшие показатели выживаемости достигнуты при хранении под вакуумом при 0-4°С и остаточной влажности 0,5-3,0%. 1 з.п.ф-лы, 2 табл. Ё

Примечание. Культуры хранят под вакуумом при .

Примечание. В числителе дано количество микробных клеток (м.кл) в пробе до лиофилизации; в знаменателе - количество микробных клеток в той же пробе после лиофи- лизации.

Таблица 2