ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS PLANTARUM, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СНИЖАТЬ УРОВЕНЬ ОКСАЛАТА И ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ И ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРОКСАЛУРИИ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/25 

Изобретение относится к микробиологии и касается штамма бактерий деструктора оксалата, который может быть использован для приготовления лечебных препаратов и продуктов лечебно-диетического назначения со специфическим лечебно-профилактическим эффектом.

Среди урологических заболеваний одно из ведущих мест занимает мочекаменная болезнь. В состав камней наиболее часто (59% всех случаев) входят кальциевые соли щавелевой кислоты оксалаты.

Исследованиями последних лет показано, что спектр клинических синдромов и патологических состояний, этиопатогенез которых может быть связан с изменением состава и функций нормальной микрофлоры, населяющей организм хозяина, в настоящее время довольно широк и имеет тенденцию к увеличению.

Одним из перспективных направлений профилактики возникновения оксалатовых камней почек и мочеточников является блокирование абсорбции щавелевой кислоты из кишечника. В этой связи заслуживают внимания данные зарубежных ученых об участии микрофлоры кишечника в метаболизме щавелевой кислоты. В этом процессе участвуют некоторые виды микроорганизмов, в основном, почвенные, способные к деструкции и модификации оксалата: Pseudomonas, Mycobacterium, Alcaligenes, Streptomyces, Clostridium и др.

Американскими учеными еще в начале 80-х годов были предприняты попытки изолировать из желудочно-кишечного тракта животных микроорганизмы, ответственные за деградацию оксалата в сычуге жвачных животных. В результате ими были селектированы облигатно-анаэробные не образующие спор оксалат-деградирующие бактерии с биологическими характеристиками, отличными от всех других ранее известных микроорганизмов, способных утилизировать соли щавелевой кислоты. Позднее сходные оксалат-деградирующие анаэробные микроорганизмы были также изолированы из кишечника других животных и человека и получили название Оxalatobacter formigenes. Данные по распространению в кишечнике человека оксалат-деградирующих микроорганизмов ограничены, хотя все исследователи, занимающиеся этим вопросом подтвердили присутствие в фекалиях человека подобных микроорганизмов. Получены также данные о возможности создания модели на животных для детализации роли анаэробных оксалатдеградирующих бактерий в метаболизме пищевого оксалата у млекопитающих. В последние годы проведен цикл исследований по изучению биохимии трансформации щавелевой кислоты и ее солей анаэробными О. formigenes. Установлено также, что количество подобных анаэробных бактерий находится в прямой зависимости от концентрации оксалатов, поступающих в кишечный тракт с пищей. У людей число таких бактерий может достигать значительных цифр. По данным Allison M. J. с соавторами именно эти бактерии ответственны за деградацию в пищеварительном тракте 50-100 мг щавелевой кислоты ежедневно.

Необходимо особо подчеркнуть тот факт, что полученные результаты исследований по данному направлению далеки от их практического использования.

Цель изобретения штамм лактобактерий, обладающий оксалат-деградирующей активностью.

Штамм Lactobacillus plantarum CS депонирован в Музее микроорганизмов представителей нормальной микрофлоры человека Московского научно-исследовательского Института Эпидемиологии и Микробиологии им. Г. Н. Габричевского под N 152.

Штамм Lactobacillus plantarum СS выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: короткие неподвижные грамположительные палочки, равномерно окрашиваемые, единичные или расположенные в виде цепочки из 2-5 клеток, величина клеток 5-10 мкм, спор и капсул не образует, микроаэрофил.

На твердой МRS среде образует плоские непрозрачные сероватые выпуклые, округлые, с ровными краями колонии размером 1,5-2 мм через 48 ч роста, консистенция маслянистая, пигмент отсутствует. В мазке расположен беспорядочными скоплениями и отдельными цепочками. Зернистость и другие включения отсутствуют.

Температурный оптимум: 38-40^о, рН среды 6,4-6,6.

Биохимические свойства.

Оксидазная проба отрицательная. Каталаза отрицательная. На средах Эндо, Плоскирева Сабуро не растет.

Способен активно развиваться на жидких питательных средах разного состава, предназначенных для культивирования лактобацилл и накапливать к 18-20 ч культивирования производственную биомассу. Ферментирует L-арабинозу, рибозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, маннит, сорбит, амигдалин, арбитин, эскулин, салицин, целобиозу, D-туранозу, глюконат, мальтозу, трегалозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, мелецитозу, раффинозу, гентобиозу: не ферментирует эритритол, D-арабинозу, ксилозу, инулин, сорбозу, рамнозу, дульцитол, ксилит, желатину не разжижает.

По результатам развернутого биохимического анализа на системе АРI-СНL штамм идентифицирован как Lactobacillus plantarum.

Отношение к антибиотикам: Чувствителен к эритромицину, карбенициллину, олеандомицину, левомицетину, оксациллину, амоксициллину; умеренно-устойчив к рифампицину, пенициллину, доксициллину, ампициллину. Устойчив к неомицину, полимиксину, тетрациклину, канамицину, ристомицину, стрептомицину, налидиксовой кислоте, ванкомицину, линкомицину. Продолжительность свертывания молока 10-12 ч. Высокая антагонистическая активность в отношении кишечной палочки, золотистого стафилококка, шигелл, протея. Безвредность: безвреден при проверке на белых мышах введением per os.

П р и м е р 1.

Штамм Lactobacillus plantarum CS выращивают на жидкой среде МРС-2 при 38^оС в течение 18 ч, затем культуру петлей рассевают на чашки Петри со средой МРС-4 и культивируют в тех же условиях. Через 18 ч готовят микробную взвесь культуры, для внесения в полусинтетическую питательную среду АРI следующего состава, г/л: Полипептон 10 Дрожжевой экстракт 5 Твин-80 1 К₂НРО₄ 2 Ацетат Na 5 Цитрат аммония 2 MnSO₄ · 4H₂O 0,05 MgSO₄ · 7H₂O 0,2 Бромкрезол красный 0,17 Оксалат Na 20 Дистиллированная вода до 1000 рН 6,9-7,0
Посевной материал вносят в опытную полусинтетическую питательную среду в количестве 10% от общего объема с конечной концентрацией бактерий в этой среде 10⁷ КОЕ/мл. Инкубирование ведут при 38^оС в микроаэрофильных условиях в течение 72 ч.

В качестве контроля используют ту же питательную среду без микроорганизмов. Для определения содержания оксалата в культурной среде методом газовой хроматографии пробы предварительно центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин. Затем к 1 мл надосадочной жидкости добавляют 0,4 мл 50% Н₂SO₄, 2 мл СН₃OH и 100 мл 1%-ного раствора фумаровой кислоты. После инкубации при 60^о в течении 30 мин во флаконе с плотно закрытой пробкой, добавляют 1 мл Н₂O и 0,5 мл хлороформа. Тщательно встряхивают и центрифугируют. Слой хлороформа берут для исследования. Количественное определение оксалата в среде проводят методом газожидкостной хроматографии на хроматографе 104: Pye Unicam (Англия) с пламенно-ионизационным детектором Shimadzu Data Processor Cromatopac C-R3A, стеклянной колонке длиной 2 м и 2 мм внутренним диаметром. Колонка заполнена Sp 1200/I/ Н₃PO₄ на Chromosorb WAW. Температура детектора 260^оС температура испарителя 250^оС Скорость подачи газа-носителя (азота) 30 мл/мин. Результаты определения способности различных штаммов лактобацилл снижать уровень оксалата представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, штамм Lactobacillus Plantarum CS снижает уровень оксалата Na в опыте in vitro через 72 ч на 46% от исходного уровня В то же время содержание оксалата Na в контрольном растворе, без добавления испытуемого штамма, сохранялось на прежнем уровне. Штамм Lactobacillus plantarum СS стабильно сохраняет способность снижать уровень оксалата при длительном пассировании на питательных средах для культивирования лактобактерий.

П р и м е р 2. Оксалатопонижающая активность штамма и исходная концентрация оксалата в опытной питательной среде. Условия проведения опыта те же что и в примере 1, добавляют разную концентрацию оксалата натрия. После инкубирования по выше указанной методике определяют конечную концентрацию оксалата в образцах и вычисляют процент снижения его уровня (табл. 2).

В табл. 2 приведена оксалатпонижающая активность штамма L.plantarum СS в зависимости от исходной концентрации оксалата Na в опытной питательной среде в течении времени.

Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч путем сравнения содержания оксалата в контрольной опытной пробах.

Оксалатпонижающая способность штамма L.plantarum СS мало зависит от исходной концентрации оксалата Nа в среде. При меньшей концентрации в первые сутки уменьшение оксалата в среде идет более активно, хотя в последующие двое суток эта разница практически нивелируется.

Таким образом, с учетом способности штамма Lactobacillus plantarum CS активно снижать уровень оксалата, развиваться на питательных средах разного состава и к 18 ч культивирования накапливать производственную биомассу, он может быть использован для приготовления фармакопейных препаратов и продуктов питания направленного действия для лечения и профилактики гипероксалурии, в том числе мочекаменной болезни.

Используется в микробиологии, может быть использован для получения бактерийных препаратов и продуктов лечебного питания направленного действия для лечения и профилактики гипероксалурии. Сущность изобретения: штамм Lactobacillus plantarum CS (коллекционный номер 152 Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека Московского научно-исследовательского Института Эпидемиологии и Микробиологии им. Г. Н. Габричевского) обладает способностью снижать уровень оксалата, развиваться на питательных средах разного состава и к 18 ч культивирования накапливать производственную биомассу. Штамм выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека. 2 табл.

Штамм бактерий Lactobacillus plantarum депонирован в ГКНМ N 152, обладающий способностью снижать уровень оксалата и используемый для получения препаратов и продуктов питания для профилактики и лечения гипероксалурии.