ШТАММ PSEUDOMONAS SPECIES-45, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОБЕССЕРИВАНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12S1/02 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и касается новой культуры микроорганизмов, которая может быть использована для обессеривания нефти и нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов Sulflobus asidocaldarius и Caldariella acidophila, выделенные из горячих кислых источников и способные окислять сероводород вулканического происхождения до серной кислоты. Данные культуры термофилы, факультативные хемолитотрофы, растут при рН от 2 до 3, сохраняют жизнеспособность и при 90 (см. Г. Шлегель. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987г. - с.353).

Приведенные штаммы недостаточно эффективны при обессеривании нефти и нефтепродуктов.

Известны бактерии, объединенные в род Thiobacillus, окисляющие серу и ее соединения - Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus ferrooxidans, Thiobacillus denitrificons, Thiobacillus thioparus, Thiobacillus intermedius и другие (см. Г. Шлегель. Общая микробиология. - М.: Мир,1987г., - с.352-353). Приведенные грам-отрицательные бактерии с полярно-расположенными жгутиками могут окислять различные соединения серы, образуя в качестве конечного продукта сульфаты.

Однако данные микроорганизмы окисляют серу в присутствии нефти в незначительных количествах, так как подавляются ее присутствием.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм Rhodococcus rodocrous -ATCC 53968, полученный путем обычной ферментации в анаэробных условиях (см. Патент РФ 2093543, МКИ С 10 G 32/00, публ. 1997г.).

Недостатком известного штамма является низкая эффективность обессеривания нефти в минерализованной воде.

В основу настоящего изобретения положена задача выделения нового штамма, характеризующегося способностью обессеривать нефть и нефтепродукты.

Поставленная задача решается путем выделения штамма Pseudomonas species -45, используемого для обессеривания нефти и нефтепродуктов. Данный штамм выделен с территории бензоколонки с почв, хронически загрязненных нефтепродуктами. Это природные микроорганизмы, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов.

Выделение штамма осуществлялось путем высева образца почвы с существующей в ней микрофлорой в питательную среду следующего состава:
Дистиллированная вода - 1000мл
NH₄NO₃ - 1,0 г
Na₂HPO₄ - 150мг
КН₂РО₄ - 150мг
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с Bergey's Manual of Systematik Bacteriology vol.l, 1994p.

Полученный штамм развивается из посевного материала на минеральной среде, используя в качестве источника углерода нефть или нефтепродукты при оптимальных рН 6,8 и температуре 24-28^oС и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки
Штамм представляет собой грам-отрицательные подвижные палочки с полярным жгутикованием и размерами 0,6-2,1 мкм. На мясо-пептонном агаре и мясо-пептонном бульоне появляются круглые, выпуклые, непрозрачные, непигментированные колонии размером 3-4 мм. Флуоресцирующий пигмент не образует.

Физиолого-биохимические признаки
Pseudomonas species-45 является аэробом с окислительным типом метаболизма. Способен расти в анаэробных условиях, используя как конечный акцептор электронов нитраты, и при общей солености среды 15%. Не нуждается в факторах роста. Оксидаза- и каталазаположительный. Хемоорганотроф. Способен к денитрификации. Не обладает аргининдигидролазой, лизинкарбоксилазой, не разрушает эскулин. Не образует ливан. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов фруктозу, мальтозу, молочную кислоту, этанол, В-аланин.

Штамм хранится в лиофилизированном виде в ампулах при комнатной температуре с использованием в качестве протектора молока. Жизнеспособность штамма поддерживают размерными пересевами (1 раз в 6 месяцев) на минеральной среде (состав приведен выше), а также на полноценной среде - мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном агаре.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) готовят следующим образом. К 1 л водопроводной воды добавляют 500 г говяжьего мяса, пропущенного через мясорубку, и оставляют настаиваться в холодильнике в течение суток. Далее процеживают, отжимают мясо и настой ставят в холодную водяную баню. Доводят воду до кипения и выдерживают настой в кипящей воде полчаса. Затем настой фильтруют. К бульону добавляют 5 г поваренной соли и 10 г пептона. Слабокислую среду нейтрализуют до слабощелочной реакции, добавляя 10% раствор бикарбоната натрия. Затем автоклавируют при 1 атм в течение 20 минут.

Мясо-пептонный агар получают добавлением к МПБ 2% агара, далее проводят нагрев в автоклаве до растворения агара. Горячую среду нейтрализуют 10% раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции. Полученный настой фильтруют и далее проводят стерилизацию при 1 атм в течение 20 минут.

Новая совокупность заявленных существенных признаков позволяет получить новый технический результат, который выражается в выделении нового штамма, используемого для обессеривания нефти и нефтепродуктов.

Анализ известных штаммов микроорганизмов, отобранных в процессе поиска, показал, что в науке и технике нет объекта, обладающего заявленной совокупностью признаков и наличием вышеуказанного свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого объекта критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Для доказательства критерия "промышленная применимость" приводим конкретные примеры по обессериванию нефти и нефтепродуктов.

Исследования по определению эффективности штамма проводят в лабораторных условиях.

Пример 1
Для определения способности штамма к окислению серных соединений, находящихся в образцах нефти, штамм выращивают на питательной среде (состав которой приведен выше). Приготовленную питательную среду разливают в колбы по 25 мл и добавляют в каждую колбу образцы нефти в количестве 2,8 г, затем проводят стериализацию. Колбы выдерживают в микроаэрофильных условиях при температуре 24^oС в течение 17 суток, определяют содержание сульфатов в жидкой фазе. Содержание сульфатов определяют методом тубидометрии по количеству сульфата бария, образуемого в кислой среде. Для этого 1 мл пробы смешивают с реактивом следующего состава:
Дистиллированная вода - 100 мл
BaCl₂•2Н₂О - 20 г
Уксусная кислота - 5 мл
Оптическое поглощение пробы (смеси реактив: проба) определяют на спектрометре "Спекол" - 221 при длине волны 600 нм.

Результаты исследований приведены в табл.1.

Как видно из данных таблицы, происходит значительное увеличение содержания окисленного серного соединения (сульфата бария).

Пример 2
Для определения содержания общей серы в образцах нефти проводят посев штамма в колбы, заполненные по 200 мл питательной среды и 20 мл нефти. Выдерживают колбы в течение 17 суток. Анализ процентного содержания серы в образцах нефти после бактериальной обработки проводят по методу, описанному Ю. Ю. Лурье, А.И. Рыбниковой. Химический анализ производственных сточных вод, 1974г.

Результаты исследований приведены в табл.2.

Как видно из данных таблицы, происходит снижение содержания серы в нефти на 30,0-50,0%.

Таким образом, полученные рузультаты свидетельствуют о том, что, используя штамм Pseudomonas species - 45, можно проводить обессеривание нефти и нефтепродуктов за счет выведения серы из нефти в биомассу микробных клеток в виде сульфатов, сероводорода. Обессеривание нефти и нефтепродуктов приводит к повышению их качества, к снижению коррозии нефтепромыслового оборудования, а также решается экологическая проблема - снижается выброс в атмосферу продуктов сгорания серы, которые приводят к выпадению кислотных осадков, что оказывает вредное воздействие на водные и лесные экосистемы.

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано для обессеривания нефти и нефтепродуктов. Штамм Pseudomonas species - 45 выделен из почвы с территории бензоколонки. Штамм развивается на минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода нефть или нефтепродукты при рН 6,8 и температуре 24-28^oС, и выводит серу из нефти в виде сульфатов, сероводорода. Использование штамма позволяет снизить содержание серы в нефти на 30,0-50,0%. 2 табл.

Штамм Pseudomonas species - 45, используемый для обессеривания нефти и нефтепродуктов.