Способ распознавания белков Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, молекулярной биологии, биоорганической химии, и может быть использовано научными учреждениями при изучении физико-химических свойств белков и полипептидов.

Целью предлагаемого изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности.

Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность белков с учетом констант для боковых групп аминокислот, определенных при переходе этанол - вода и Ь1-циклогексил-2-пирролидон - вода. После этого находят коэффициенты корреляции между содержанием аминокислот и гидрофобностью и по этим значениям определяют принадлежность белков к тому или иному классу (фракции).

Пример 1. Берется не менее 10 различных самоопыленных линий кукурузы. Из зерен каждой линии удаляют зародыши, эндосперм размалывают до тонкого порошка, отвешивают 10 г муки, приливают 100мл 70%-ного этанола, содержащего 2 М мочевины, и помещают на водяную баню на 1 ч. После этого суспензию центрифугируют при 7000д в течение 15 мин. Надосадочную жидкость упаривают под феном до 1 /5-1 /7 первоначального объема и используют для электрофоретического разделения белков в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ), содержащего 8 М мочевины. После завершения электрофореза гели опускают на короткое время в 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), после чего из геля вырезают участки с опалесцирующи- ми белковыми зонами, их гомогенизируют с 2 объемами 0,1 н.раствора МаОН. Затем гель осаждают центрифугированием, а к надосадочной жидкости приливают равный

О

от ю

00

о

объем 40% (ТХУ), и белок осаждают центрифугированием при БбОООд 20 мин. После этого белок суспендируют в 6 н. HCI, запаивают в ампулы и помещают для гидролиза при 110°С в течение 22 ч. Полученный гид- ролизат анализируют на наличие аминокислот на аминокислотном анализаторе и вычисляют аминокислотный состав. Далее содержание каждой аминокислоты умножают на соответствующие константы, опреде- ленные для перехода этанол - вода, М-цмклогекеил-2-гшрролидон - вода (данные по А-субфракции проламина в табл,1). Затем суммируют полученные значения и делят на 100 (поскольку расчет велся изначально в молярных %}. Тем самым находят среднюю гидрофобность данного белка. Аналогичную операцию проводят со всеми самоопшшнными пиниями кукурузы. Для того чтобы удостовериться, что выделенные белки яэлязотся проламмгнами, рассчитывают коэффициенты корреляции между средней гидрофобностью w глицином, фемшшяанмном также между треонином - глицином, гяутаиижнюй кислотой, гардати- ном, лизином, аргинином и r/дацмжш. Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными для данной культуры {табл.2). В случае совпадений знаков и цифр е пределах & 10% следует считать этот белок пропамино-м.

Л р и м е р 2. Берут зрелое зшрмо «е менее 10 линий кукурузы. Ш зерен удаляют звредыш и эндосперм, разшдышш да тонкого порошка, к 10 г муки приливают 100 wi 0.8%-ного додецмлсульфата МаЩДСМа), приготовленного на 0,05 Ы Na-фосфатном буфере, рН 7,0, и ставят на магнитную мешалку на 1 ч, затем центрифугируют при 7000Q в течение 15 мин. Надоса#очную жидкость удаляют, а осадок заливают 20 мл 1,5% ДДСМа на том же буфере и акстраги- руют белок при энергичном помешивании в течение 0,5 ч. Суспензию центрифугируют при 7000д 15 мин. Супернатаит сливают, к нему приливают этанол до 75% концентрации м выдерживают в холодильнике 0,5 ч. После центрифугирования осадок анализируют на содержание аминокислот как описано в примере 1. Дальнейшие этапы расчета описаны в примере 1 и даны в табл.1 для глютелина. Расчет коэффициентов корреляции осуществляют между значениями средней гидрофобности и глутаминовой

кислотой, пролином, глицином, фенилала- нином, лейцином, а также между парами аминокислот; аспарагиновой - глутаминовой, глицином - фенилаланином; лизином аргинином, лизином-аспарагиновой кислотой, треонином - глицином, треонином - фенилаланином. Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными для данной культуры (табл.3). В

случае совпадения знаков и цифр в преде- flaxi10% следует считать этот белок глюте- лином.

Примерз. Зрелое зерно не менее 10 сортов пшеницы размалывают до тонкого

порошка. Отвешивают 1 г муки, приливают 10 мл 1 М №CI и выдерживают в холодильнике в течение 1 ч с периодическим помеши- ванием. Центрифугируют при 7000д в течение 15 мин. В насдосадной жидкости

определяют аминокислотный состав со всеми дальнейшими операциями, описанными в примере 1. Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными данными для пшеницы (табл.2). В

случае совпадения цифр в пределах ±10%, следует считать этот белок альбумино-гло- буяиновой фракцией.

Как следует из табл.2, 3 и 4, эталонные

коэффициенты корреляции для распознавания белков являются общими в определенных пределах для всего семейства Злаковых, в крайнем случае ограничиваются рамками вида (табя.5 и 6). Поэтому инфорювдия о конкретных сортах или линиях исследуемых растений не имеет значения. Форму я а изобретения Способ распознавания белков, включающей аминокислотный анализ белковой

пробы и расчет коэффициентов корреляции между аминокислотами,отличающий- с я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей и повышения точности исследований за счет увеличения

информативности, в белковой йробе дополнительно вычисляют среднюю гидрофобность, используя константы для боковых групп аминокислот, определенные для переходов этанол - вода и М-циклогексил-2пирролидон - вода, определяют коэффициенты корреляции между гидро- фобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность белков к тому или иному классу.

Таблица

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гидрофобностью альбуминов и глобулинов зерна

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимическим исследованиям. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности. Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидро- фобность в калориях на остаток с учетом констант для боковых групп аминокислот, определенных для переходов этанол - вода и М-циклогексил-2-пирролидон - вода, рассчитывают коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность к тому или иному классу белков.

Примечание, Здесь и для других таблиц: Гидрофобность (Э) - средняя гидрофобность при

переходе этанол - вода Гидрофобность (Ц) - средняя гидрофобность при переходе М-циклогексил-2-пирролидон - вода.

Таблица 3 Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гидрофобностью проламннов зерна

Таблица

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гидрофобностью глютелинов зерна

Признак

Глутаминовая кислота - гидрофобность (Ц)

Пролин - гидрофобность Глицин - гидрофобность Глицин - гидрофобность

Фенилаланин - гидрофобность (Э)

Лейцин т гидрофобность

Аспарагиновая .- глута- миновая кислота

Глицин - фенилаланин Лизин - аргинин

Лизин - аспарагиновая кислота

Треонин - глицин Треонин - фенилаланин

Глутаминовая кислота - глицин

Вапин - лизин

Глутаминовая кислота - изолейцин

-0,63

-0,57

-0,87

-0,43

Таблица 5

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и гидро- фобностью специфических белков зерна кукурузы

Признак

Белок глютелинового типа с высоким содержанием проли

Пролин - гидрофобность (Э)0,83

Аспарагиновая кислота - пролин-0,79

Аспарагиновая кислота - валин-0,75

Аспарагиновая кислота - фенилаланин0,70

Треонин - серии0 76

Треонин - лейцин-0,65

Пролин - фенилаланин-0,69

Алании - валин .-0,67

Алания - лейцин0,81

Валин - фенилаланин-0,71

Валин - гистидин0,62

Изолейцин - лизин0,68

Тирозин - гистидин-0,69

, Тирозин - аргинин-0,66

Белок глютелинового типа с повышенным содержанием серина и глицина

Пролин - гидрофобность (Э)0,72

Треонин - аланин-0,64

Треонин - валин-0,77

Глутаминовая кислота - валин-0,63

Глутаминовая кислота - лейцин0,63

Глутаминовая кислота - лизин-0,81

Глицин - лейцин-0,69

Глицин - гидрофобность (Ц)-0,83

Валин - гидрофобность (Э)0,63

Валин - лизин 0,60

III

Таблица 6

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гидрофобностью высокомолекулярного глютелина зерна пшеницы

Признак

Глутамииовая кислота - гидрофобность (Ц) . О,72

Пролин - гидрофобность (Ц)0,68

Валим - гидрофобность (Э)0,72

Фенилаланин - гидрофобность (Э)0,69

Треонин - тирозин0,71

Изолейцин - гидрофобность (Э)0,80

Изолейцин - лейцин0,62

Изолейцин - тирозин-0,62

Лейцин - тирозин .-0,89

Лейцин - фенилаланин0,65

Тирозин - фенипаланин-0,74

I