Способ определения активности холинэстеразы в крови и устройство для его осуществления Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии

Целью изобретения является упрощение способа и повышение точности определения активности холинэстеразы в крови.

На чертеже представлена функциональная схема устройства для осуществления предлагаемого способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Приготавливают реакционную смесь, состоящую из трис-буфера рН 8,0 и БАС-С (4,4-Бис-(1-гидрокси-8-хлор-3,6-дисульфо-2 -нафтилазо)дифенилдисульфид динатрие- вая соль, трехводная). Смесь помещают в кювету, добавляют пробу цельной крови человека, перемешивают встряхиванием, добавляют субстрат-дитиохолиновый эфир пробковой кислоты и фотометрируют.

П р и м е р 1. Для измерения активности холинэстеразы в крови человека приготавливают реакционную смесь, содержащую 3,0 М трис-буфера рН 8,0 и 1,2 М БАС-CI. Эту смесь в объеме 5 мл помещают в медицинский флакон, затем в нее вводят 0,05 мл цельной крови человека и перемешивают смесь встряхиванием. Кювету устанавливают в фотометрический блок, в реакционную смесь добавляют 1 мл 5 М дитиохолинового эфира пробковой кислоты и фотометрируют с помощью специального устройства.

Активность холинэстеразы в крови рассчитывают по формуле

00

ю

Јь

ю

А

mi Ki 60 10

-з

V

р

где mi - количество микромолей суберилди- тиохолина, подвергшегося гидролизу при анализе;

Ki - температурный коэффициент, учитывающий зависимость измерений от температуры пробы (, так как температура растворов 25°С);

г - время гидролиза субстрата, с

Vnp - объем цельной крови, вносимый в пробу.

В таблице представлены результаты измерения активности холинэстеразы в цельной крови предлагаемым способом

Устройство для осуществления предлагаемого способа содержит измерительный блок 1, дозатор 2, дифференциатор 3, делитель 4 напряжения, блок 5 памяти компаратор б, регистратор 7, блок 8 запуска.

Измерительный блок 1 может быть выполнен, например, в виде фотометрической ячейки, содержащей источник света на лампе МН 2,5 В - 0,15 А и фотоприемник на фоторезисторе СФ-2,5, в качестве разовых кювет используют медицинские флаконы

Дозатор 2 выполнен в виде электрически управляемого автоматического дозатора, например медицинского дозатора А--2 работающего в режиме разового дозирования.

Дифференциатор 3 выполнен по известной схеме на микросхеме с высоким сопротивлением входа. Делитель 4 напряжения, выполненный на двух резисторах, производит деление сигнала с заданным коэффициентом. Блок памяти 5 выполнен на конденсаторе К73ПЗ и микросхеме КР 544УДД1А, компаратор б - по известной схеме.

Трехразрядный регистратор 7 выполнен по стандартной схеме с цифровым представлением информации Блок 8 зяпу- ска представляет собой коммутационное устройство, выполненное на переключателях П2К.

Устройство работает следующим обря зом.

Для измерения активности холинэсте разы в крови человека приготовляют реакционную смесь, содержащую 3,0 10 (М трис-буфера рН 8.0 и 1 2 10 М БАС CI (4,4-Бис-(1-гидрокси-8-хлор-3 6-дисульфо-2 -нафтилазо)дифенилдисульфид динагрие вая соль, трехводная). Эту смесь в объеме 5 мл помещают в медицинский флакон затем в нее вводят 0,05 мл цельной крови человека и перемешивают смесь встряхиванием К ю вету устанавливают в измерительный блок 1, в реакционную смесь добавляют 5 0 М раствор дитиохолинового эфира проГкп

вой кислоты в объеме 1 мл посредством автоматически управляемого дозатора А-2, работающего в режиме разового дозирования,

При нажатии кнопки Пуск на панели

прибора электрическим импульсом через блок 8 запуска включается регистратор 7 одновременно с дозированием раствора субстрата. Перемешивание реагентов в

0 пробе осуществляется барботажем воздухом.

В ходе ферментативного гидролиза субстрата образуется тиохолин, вступающий в реакцию с хромогенным красителем

5 БАС-CI с образованием окрашенного продукта. Накопление окрашенного продукта вызывает увеличение оптической плотности раствора,что приводит к изменению сопротивления фоторезистора измери0 тельного блока 1 и уменьшению напряжения на входе дифференциатора 3. С его выхода продифференцированный сигнал подается на инверсный вход компаратора б и резистивный делитель 4. С выхода де5 лителя 4 половинное напряжение сигнала поступает в блок 5 памяти, где это половинное значение запоминается и используется в виде опорного напряжения, подаваемого на второй вход компаратора

0 6. В компараторе 6 происходит сравнение текущего сигнала производной с дифференциатора 3 с опорным сигналом с блока 5 памяти

По окончании реакции полного гидро5 лиза происходит уменьшение текущего сигнала производной и в момент достижения равенства сигнала опорному напряжению на выходе компаратора 6 возникает сигнал Стоп, останавливающий регистра0 тор 7 Время полного гидролиза в секундах считывается оператором с регистратора.

Точность измерения активности холинэстеразы с помощью предлагаемого способа и устройства повышается примерно в

5 десять раз по сравнению с известным. Формула изобретения 1 Способ определения активности холинэстеразы в крови по изменению оптической плотности реакционной смеси,

0 состоящей из пробы цельной крови, тиохо- линового субстрата и хромогенного реагента отличающийся тем, что. с целью упрощения способа и повышения точности определения, в качестве субстрата исполь5 зуют дитиохолиновый эфир пробковой кислоты, а в качестве хромогенного реагента используют БАС-CL (4,4-Бис-{1-гидрокси-8- хлор-3.6-дисульфо-2-нафтилззо)дифенилди сульфид динатриевая соль), при этом активность фермента определяют по времени

прекращения изменения оптической плотности реакционной смеси,

2. Устройство для определения активности холинэстеразы в крови, содержащее измерительный блок, блок запуска и остановки, регистратор, отличающееся тем, что, с целью повышения точности определения активности холинэстеразы в крови в него введены дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор, электрически управляемый дозатор, выход которого соединен жидкостной

коммуникацией с входом измерительного блока, а вход - с первым выходом блока запуска, выход измерительного блока соединен с входом дифференциатора, выход

которого соединен с первым входом компаратора и входом делителя напряжения, выход которого соединен с входом блока памяти, выход которого соединен с вторым входом компаратора, выход которого

соединен с первым входом регистратора, второй вход которого соединен с вторым выходом блока запуска.

-5

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии. Цель - повышение точности и обеспечение автоматизации измерений. Цель достигается путем введения в реакционную смесь, состоящую из пробы цельной крови, трис-буфера и БАС - CL, в качестве тиохолинового субстрата дитиохолинового эфира пробковой кислоты и определения активности холинэстеразы по времени полного гидролиза субстрата с помощью специального устройства. Специальное устройство состоит из известного устройства, в которое дополнительно введены электрически управляемый дозатор, дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор. Устройство обеспечивает цифровую индикацию времени полного гидролиза субстрата. Изобретение позволяет повысить точность определения примерно в 10 раз. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.

«Г

8