Ингибиторы холинэстераз Советский патент 1984 года по МПК C12N9/18 

9)

:о

00

Изобретение относитсУ к энзимологии, конкретно к ферментам гидролазам карбоновых кислот, и может быть использовано в практике биохимических медицинских лабораторий для классификации ферментов холинэстераз и выяснения особенностей их строения

Известны четвертичные аммониевые соединения тетраметиламмоний N (CH)ij Х (ТМА) и тетраэтиламмоний N(CjH5)4X ТЭА), где X - галоген, обладающие ингибирую1дам действием на ферменты холинэстеразы: типичные ацетилхолинзстеразу (АХЭ; КФ 3.1.1.7 и бутирилхолинэстеразу (БуХЭ;

КФ 3.1.1.8). Антихолинэстеразное действие четвертичных аммониевых соединений известно ,

Недостатками данных четвертичных аммониевьк соединений являются малая величина ингибирующего действия па ферменты холинэстеразы и малая избирательность ингибирующего действия на один из двух типов хопинэстераз (АХЭ или БуХЭ).

Целью изобретения являются сильные обратимые ингибиторы холинэстераз с выраженной избирательностью ингибирующего действия или к АХЭ, или к БуХЭ и расширение ассортимента ингибиторов ферментов для выяснения различий в строении активного центра ферментов.

,Поставленная цель достигается применением в качестве ингибиторов ферментов холинэстераз четвертичных фосфониевых соединений.

Ранее не было известно об использовании этих соединений в качестве ингибиторов холинэстераэ. Они предназначались лишь для органического синтеза.

Пример 1.К1мл1мМ раствора реактива Элмана, т.е. 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты), в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) добавляют 1 мл раствора фермента, . 1 мл 0,5 М раствора КС, 1 мл Н20 (в контрольной пробе) или 1 мл раствора ингибитора (в опытной пробе) и затем 1 мп 2,5 мМ раствора субстра

та ацетилтиохолина (АТХ). В качестве фермента используют или АХЭ из эритррцитов крови человека, или БуХЭ из сыворотки крови лошади (серийные образцы препаратов). В качестве ингибитора используют или предлагаемое четвертичное фосфониевое соединение, или известное как ингибитор четвертичное аммониевое соединение.

С помощью фотоэлектроколориметра ФЭК - 56М (светофильтр № 3) измеряют время (с) за которое оптическая плотность реакционной смеси возрастает на величину 0,1 (t - в контрольном опыте без ингибитора i оп опыте с ингибитором). Увеличение оптическо плотности обусловлено образованием желтого продукта взаимодействия реактива Элмана с тиохолином, образующимся при ферментативном гвдролизе субстрата АТХ. Подбирают концентрацию ингибитора равной зо т.е. такой, чтобы скорость ферментативного гидролиза уменьшилась под действием ингибитора вдвое ( 2). Чем меньше величина Ugo сильнее ингибитор .

В таблице представлены неличины Здр при взаимодействии хо.тинэстераз с предлагаемыми и известными ингибиторами.

Из данньк таблицы следует, что предлагаемые ингибиторы проявляют на холинэстеразы намного более сильное ингибирующее действие, чем известные четвертичные аммониевые соединения. Так, предлагаемое соединение Вг превосходит известньп1 ингибитор (ТМА) по величине ингибирующего действия на БуХЭ в 3600 раз (7200:2 3600) и на АХЭ в 168 раз (6200:37 168). Кроме того, предлагаемые ингибиторы превосходят известные (четвертичные аммониевые соли) по избирательности действия на АХЭ или на БуХЭ. Например, ингибирующее действие соединения В яа БуХЭ в 18 раз сильнее, чем на АХЭ, а соединения В, на АХЭ в 9 раз сильнее, чем на БуХЭ. (540:58 9). Известные и ТЭА почт не проявляют избирате-пьности.

Предлагаемый

10

Известный

ТМА

ТЭА

Вг

4 2

БуХЭ y Вг БуХЭ

37 4 АХЭ

-Br БуХЭ

50 АХЭ

jBr

540 БуХЭ

58 АХЭ

7200 БуХЭ 6200 АХЭ 4800 БуХЭ 4700 АХЭ

Применение четвертичных фосфониевых соединений общей формулы R - P(R2)5Br где R, - CHsCCH ; СН СНСН2 или СН -СНз-СН 2. ИЛИ C(, RO - CftHj 2 в качестве ингибиторов холинэстераз (Л с