СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО ДЕЙСТВИЯ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/46 G01N31/22 

Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды.

Многие токсичные соединения являются ингибиторами холинэстеразы (ХЭ), что успешно используется для разработки ферментативных методов их анализа.

Ферментативные способы анализа соединений антихолинэстеразного действия, к числу которых относятся высокотоксичные фосфорорганические инсектициды, отравляющие вещества и карбаматы, основаны на измерении исходной активности холинэстеразы (ХЭ) в контрольном опыте и после взаимодействия с анализируемой пробой с последующим определением степени ингибирования фермента.

К настоящему времени разработан целый ряд способов определения активности ХЭ, которые отличаются друг от друга используемым субстратом и методом регистрации аналитического эффекта [1-5].

Известен визуальный способ анализа соединений антихолинэстеразного действия, основанный на регистрации времени, необходимого для выравнивания окраски анализируемой пробы воды (водного экстракта), в которую внесены холинэстераза сыворотки крови лошади (ЛХЭ), субстрат бутирилхолин йодистый и pH индикатор, с окраской эталона [6, 7]. Этот способ является аналогом предлагаемого.

Способ-аналог имеет ряд недостатков: необходимость тщательной нейтрализации анализируемой пробы воды (водного экстракта), проведение ингибирования ЛХЭ и ферментативного гидролиза субстрата вне диапазона оптимальных условий проявления активности фермента. Погрешность результатов анализа водных экстрактов может возрастать в случае содержания в них соединений, влияющих на буферную емкость реакционного раствора, в котором проводится анализ. Визуальная регистрация аналитического эффекта также может приводить к увеличению погрешности. Особенно затрудняется интерпретация результата анализа при искусственном освещении. Указанные выше недостатки увеличивают погрешность результатов анализа.

Часть этих недостатков снимается при использовании фотоколориметрического способа анализа соединений антихолинэстеразного действия, предусматривающего проведение анализа в среде буфера с использованием ферментов из различных биологических источников: пропионилхолинэстеразы из мозговой ткани (ПХЭ), ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (АХЭ) и холинэстеразы сыворотки крови лошади (ЛХЭ) [8].

Этот способ включает экспозицию анализируемой пробы воды (водного экстракта) с соответствующей холинэстеразой и 5,5''-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) в среде фосфатного буфера (pH 7,5) с последующим добавлением субстрата ацетилтиохолина йодистого, при ферментативном гидролизе которого выделяется тиохолин. Тиохолин взаимодействует с 5,5''-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты (максимум светопоглощения при 412 нм)
^-S(CH₂)₂ N(CH₃)₃N⁺J^-+ RS-SR--->RS-S(CH₂)₂N(CH₃)₃N⁺ J^-+RS^-
Регистрация аналитического эффекта проводится на фотоэлектроколориметре (спектрофотометре) при длине волны 412 нм.

Данный способ имеет наибольшее число общих признаков с предлагаемым и принят нами в качестве прототипа.

Способ-прототип снимает погрешности, связанные с влиянием pH среды пробы и визуальной регистрацией аналитического эффекта на результаты анализа пробы.

Однако способ-прототип сложен в исполнении и трудоемок. К числу существенных недостатков способа-прототипа следует отнести сложности, возникающие при анализе водных экстрактов, которые часто окрашены в желтые тона и имеют интенсивную полосу поглощения в той же спектральной области, что и анион 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты. Это приводит к необходимости разбавлять или обесцвечивать анализируемую пробу водного экстракта перед анализом, что ведет к снижению чувствительности анализа пробы. Регистрация аналитического эффекта по способу-прототипу осуществляется по времени t_оп, за которое значение оптической плотности реакционного раствора возрастает на величину 0,05 или 0,10. В выбранных условиях t_оп может достигать до 20 минут в зависимости от концентрации анализируемого соединения в пробе.

Трудоемкость обсуждаемого способа также возрастает в связи с необходимостью готовить раствор сравнения для каждой анализируемой пробы того же состава, что и рабочий раствор, за исключением субстрата.

Указанные выше недостатки ведут к увеличению как погрешности результата анализа, так и времени его проведения.

Предлагаемое решение направлено на снижение предела определения и погрешности анализа соединения антихолинэстеразного действия, а также устранение необходимости разбавления анализируемых окрашенных экстрактов.

Технический результат достигается тем, что в способе определения соединения антихолинэстеразного действия, включающем измерение скорости ферментативного гидролиза ацилтиохолина, в качестве индикатора на тиольную группу используют 4,4''-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевую соль (далее БАС),
анализ проводят в оптимальных для конкретного препарата ХЭ условиях, регистрацию аналитического эффекта осуществляют фотоколориметрической регистрацией аналитического эффекта по тангенсу угла наклона начального участка кинетической кривой ферментативного гидролиза бутирилтиохолина (БТХ) при длине волны 575 нм.

Выбор индикатора на тиольную группу 4,4''-бис-(2-гидрокси- 6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли обусловлен как его спектральными параметрами, так и его стабильностью при хранении.

Так, продукт взаимодействия БАС с тиохолином имеет полосу поглощения в синей области спектра ( λ_max = 575 нм), что позволяет анализировать окрашенные водные экстракты без предварительного их разбавления или обесцвечивания.

При прочих равных условиях чувствительность фотоколориметрического анализа определяется величиной мольного коэффициента поглощения ε_λ индикатора. Величина мольного коэффициента поглощения продукта взаимодействия БАС с тиохолином ε_λ составляет 42100 л•моль^-1/см^-1. Это в 3 раза выше, чем для продукта взаимодействия 5,5''-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) с тиохолином - 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты, значение ε_λ для которой составляет 13600 л•моль^-1/см^-1 [11].

Измерение скорости ферментативного гидролиза бутирилтиохолина йодистого по тангенсу угла наклона начального участка кинетической кривой позволяет отказаться от необходимости готовить для каждой анализируемой пробы раствор сравнения, содержащий все компоненты реакционного раствора, кроме субстрата. Благодаря используемому способу измерения скорости ферментативного гидролиза субстрата регистрация аналитического эффекта при любой концентрации соединения антихолинэстеразного действия в анализируемой пробе возможна через 30 - 90 с после добавления субстрата в реакционный раствор.

Использование специфичного для каждого препарата ХЭ субстрата и оптимального значения pH позволяет повысить чувствительность анализа.

К числу недостатков способа-прототипа следует отнести и использование ацетилтиохолина йодистого для всех препаратов ХЭ из различных биологических источников, в то время как предпочтительно использование специфичного субстрата. Ацетилтиохолин также может быть использован в качестве субстрата, однако при этом погрешность результатов анализа существенно возрастает.

Более высокое сродство ЛХЭ к БТХ, чем к АТХ, следует из значений констант Михаэлиса К_м (см. табл. 1).

Именно проведение анализа не в оптимальных для ЛХЭ условиях и использование менее специфичного для данного фермента субстрата определяют его недостаточную чувствительность к соединениям антихолинэстеразного действия способа-пототипа (см. табл. 2). Эффективность предлагаемого способа показана на примере фермент-субстратной системы ЛХЭ-бутирилтиохолин йодистый
Выбор ЛХЭ обусловлен высокой стабильностью его препаратов, в то время как используемые в способе-прототипе препараты холинэстеразы ПХЭ и АХЭ отличаются низкой стабильностью даже при хранении в лиофилизированном состоянии, а в виде рабочих растворов срок их хранения при температуре 25^oC составляет 8 часов [8]. И ПХЭ и АХЭ ингибируются высокими концентрациями субстрата, что затрудняет выбор его оптимальной концентрации. ЛХЭ отличается более высоким сродством к бутирилтиохолину (см. табл. 1), чем к ацетилтиохолину, поэтому в предлагаемом способе используется бутирилтиохолин йодистый. Достоинством последнего также является его более высокая гидролитическая устойчивость по сравнению с ацетилтиохолином. Именно проведение анализа предлагаемым способом в оптимальных условиях, при которых ЛХЭ проявляет максимальную активность по отношению как к ингибитору, так и субстрату бутирилтиохолину йодистому, позволило повысить чувствительность анализа соединений антихолинэстеразного действия.

Существенные признаки предлагаемого способа и способа-прототипа приведены в табл. 3.

Пример 1.

Проведен анализ десяти проб воды и водных экстрактов с заданными значениями концентрации O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этилметилтиофосфоната. Полученные значения были сопоставлены с результатами анализа способом-прототипом [8].

Для проведения анализа были использованы следующие реагенты (отечественного производства):
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 4198-78, "хч".

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ГОСТ 4172-78,"хч".

Препарат холинэстеразы сыворотки крови лошади VI класса, лиофилизированный, ТУ 5765/42.14-42-86.

Бутирилтиохолин йодистый, ТУ 6-09-09-684-76, "хч".

4,4''-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1 -нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевая соль (БАС), ТУ 6-09-09-209-84.

O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этилметилтиофосфонат, 90% действующего начала.

Для проведения анализа использовались следующие растворы.

Фосфатный буфер, 0,7 моль/л, pH 8,5; срок хранения раствора при комнатной температуре (в темном месте) не менее четырех недель.

Раствор БАС, 550 мкмоль/л, срок хранения при комнатной температуре 3 месяца (при температуре 4^oC - не менее 6 месяцев).

Раствор бутирилтиохолина йодистого, 15 мкмоль/л, в 550 мкмоль/л БАС, (субстрат-индикаторный раствор), срок хранения раствора при комнатной температуре не менее суток, при температуре 4^oC - не менее двух суток.

Раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади в фосфатном буфере, 1 АЕ/мл, срок хранения раствора не менее двух суток при комнатной температуре и десять суток - при 4^oC.

Измерения скорости ферментативного гидролиза субстрата проводили на фотометре фотоэлектрическом КФК-З (ГОСТ 15150-69) при длине волны 575 нм и температуре 25^oC.

Ход анализа
В пробирку последовательно вносили 3 мл анализируемой пробы воды (дистиллированной воды при измерении исходной активности фермента), 0,5 мл раствора холинэстеразы, включали секундомер, через 15 минут вносили 0,5 мл субстрат-индикаторного раствора, включали секундомер, переливали реакционный раствор в кювету, кювету помещали в фотометр КФК-3 и через 30 с после добавления субстрата нажимали на кнопки "А" и "1" микрокомпьютера фотометра. Через 60 с снимали показания прибора - значение тангенса угла наклона на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата.

Средние значения из 3 параллельных измерений концентрации O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этилметилтиофосфоната в пробе воды предлагаемым способом представлены в табл. 4.

Зависимость отклика (тангенса угла наклона начального участка на начальном участке кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата) от концентрации O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этил-метилтиофосфоната носит линейный характер в интервале концентраций 0,27 мкг/мл - 1,95 мкг/мл и может быть представлена следующим уравнением регрессии:
tg α = 0,086 - 48000C,
где С - концентрация O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этил-метилтиофосфоната.

Анализ приведенных в табл. 4 градуировочных растворов способом-прототипом, как и следовало ожидать в соответствии с данными табл. 2, не дал положительных результатов. С учетом относительной погрешности результатов измерения по способу- прототипу (16%) чувствительность предлагаемого способа в 10 раз выше способа-прототипа по отношению к O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этилметилтиофосфонату.

Результаты анализа представлены в табл.4.

Уравнение регрессии, приведенное на странице 11, справедливо для приведенных выше условий анализа (pH, температура, природа буфера, ионная сила реакционного раствора, исходная активность холинэстеразы и т.д.). Поэтому в литературе принято определять степень угнетения фермента соединением антихолинэстеразного действия. В предлагаемом способе содержание соединения антихолинэстеразного действия в анализируемой пробе определяют по предварительно установленной зависимости степени угнетения холинэстеразы (в процентах) от концентрации ингибитора, причем степень ингибирования J вычисляют по формуле
J = (1-tgα_оп/tgα_кон)•100% ,
где tgα_кон - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в контрольной пробе,
tgα_оп - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в опытной пробе.

Приведенные данные позволяют сделать заключение о более высокой чувствительности и меньшей трудоемкости предлагаемого способа измерения концентрации соединений антихолинэстеразного действия по сравнению со способом-прототипом.

Использованные литературные источники
1. ЕР 0533283 B1, lnt.Cl⁶ C 12 Q 1/46, G 01 N 33/52, G 01 N 31/22. Assay for serum cholinesterase activity. 11.12/1996, Bulletin 1996/50.

2. ЕР 0464388 Al Int. Cl⁶, C 12 Q 1/00, C 12 Q 1/46. Date of filing: 06.06.91. Detection assays having chromogenic and non chromogenic, hypo chromogenic, batho chromogenic or hypo chromogenic substrates.

3. ЕР 0176585. Int.Cl⁶ C 12 Q 1/46, C 12 N 11/12. Date of publication patent specification 27.07.88.

4. Makower A. Et al. Affiniti enzymometric assay for detection of organophosphorus compouds/ Analytica Chimica acta. 1997, v.357, pp 13 - 20.

5.Chmelarova M. Et al. Coil. Czech. Chem Comm. 1966, v.31, 1886.

6. Руководство по работе в автомобильной радиометрической и химической лаборатории АЛ-4М. Москва, Военное издательство. 1988.

7. Лаборатория переносная для водоочистительных станций ПЛВС. Техническое описание и инструкция по эксплуатации. МО СССР. 1987.

8. Методики определения микроконцентраций фосфорорганических отравляющих веществ вероятного противника с использованием препаратов холинэстеразы из различных источников. Главное управление по производству бактерийных и вирусных препаратов. Министерство здравоохранения СССР. Пермь 1978 год.

9. Технические условия изготовления препаратов холинэстеразы TV-5765/42.14-42-76. Министерство здравоохранения СССР.

10. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. Москва. Наука. 1965, стр.162.

11. Ridless P.W. et al. Analyt. Biochem. 1979. V 94, N 1, pp.75 - 81.

Изобретение относится к контролю загрязнений окружающей среды. Способ включает измерение скорости ферментативного гидролиза субстрата ацилтиохолина холинэстеразой в среде буфера в отсутствие и присутствии анализируемой пробы с использованием индикатора на тиольную группу. В качестве индикатора используют 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевую соль. Скорость измеряют по тангенсу угла наклона начального участка на кинетической кривой. Изобретение направлено на снижение предела определения и погрешности анализа соединения антихолинэстеразного действия, а также устранение необходимости разбавления анализируемых окрашенных экстрактов. 2 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ определения соединения антихолинэстеразного действия в воде и водных экстрактах, включающий измерение скорости ферментативного гидролиза субстрата ацилтиохолина холинэстеразой в среде буфера в отсутствии и присутствии анализируемой пробы с использованием индикатора на тиольную группу, отличающийся тем, что в качестве индикатора на тиольную группу используют 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевую соль, а скорость ферментативного гидролиза ацилтиохолина измеряют по тангенсу угла наклона начального участка на кинетической кривой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение скорости ферментативного гидролиза субстрата ацилтиохолина проводят фотометрическим методом при длине волны 575 нм по зависимости оптической плотности анализируемого раствора, содержащего анализируемую пробу воды или водного экстракта, препарат холинэстеразы, бутирилтиохолин, 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевую соль и буфер, от времени измерения. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию соединения антихолинэстеразного действия определяют по предварительно установленной зависимости степени ингибирования холинэстеразы J (в %) от концентрации анализируемого соединения, причем степень ингибирования холинэстеразы J определяют по формуле
J = (1-tgα_оп/tgα_кон)•100,
где tgα_кон - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в контрольной пробе;
tgα_оп - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в опытной пробе.