Способ хранения микроорганизмов Советский патент 1991 года по МПК C12N1/00 C12N1/00 C12R1/00 

Иаобретение относится к микробиологии и может быть использовано для хранения в музейных и лабораторных коллекциях культур микроорганизмов.

Цель изобретения - упрощение способа при сохранении жизнеспособности клеток.

Изобретение заключается в том, что клетки микроорганизмов, выращенные на агаризованной среде, переносят на полоску хроматограсЬическон или стекловолокнистой бумаги. Бумагу с находящимися на ней клетками микроорганизмов помещают в стерильный пенициллино- вый флакон или полиэтиленовую ампулу, которые герметически закрывают и помещают в холодильник (от -40 до -80 С) или в жидкий азот (-196°С). Использование биомассы с поверхности агаризованной среды позволяет сохранить и использовать внеклеточные полисахариды, обладающие криопротекторными свойствами. Предотвращение образования кристаллов льда обеспечивается мягким обезвоживанием с помощью бумаги.

Бумага служит матриксом-носителем, обеспечивающим обезвоживание, иммобилизацию и стабилизацию клеток. Могут быть использованы различные типы хроматографической бумаги, например ватман № 1,2,3 и др., стекловолокннс- тые бумаги GF/F и GF/A.

Предлагаемым способом проверено хранение большого количества различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей), среди них 120 штаммов метано- трофных бактерий родов Methylomonas, , Methylobacter, Methylosinus, Methyloоь

sj

сэ

00

to

cvst.is, как наиболее трудных для поддержания и хранения.

Ытаммы мотанотроЛных бактерии, проверенною на хранение предлагаемым способом, и указанные в табл. 1, хранятся в ИБФИ АН СССР в лаборатории радноактивн1,1х изотопов.

Проверку выживаемости культур микроорганизмов после хранения проводят суспендиро ванисм клеток с бумаги в питательной среде, просчетом общего чис- па клеток в сЪиксированных и окрашенных препаратах аликвоты суспензии иод микроскопом, и прорапцшанием равной аликвоты на твердых: средах для выявления жизнеспособных клеток, образующих колонии.

Пример 1. Чистую культуру Methylomonas methanica 12 выращивают на косяках с агаризованной средой (27, агара Днфко), следующего состава, г/л дистиллированной воды): KNCvj 1,0; ,0 0,2; CaCl. 0,02; NaiHP04-5H20 1,5; КН2РОф 0,7; мг/л: трялон Б 0,5; FeS04 7HtO 2,0; ZnSO4 7НгО 0,1; MgCl2 4H20 0,03; СоС12 6НгО 0,2; СиС12-5НгО 0,1; NiClz-6HzO J.02; ЫаНоОц 0,03. рН среды 6,9-7,1. Среду стерилизуют при 1 атм в течение 1 ч. Выращивание проводят в вакуумном эксикаторе, заполненном смесью метана и воздуха (1:1).

Петлей переносят клетки с косяка на полоску стерильной бумаги ватман № 1, помещенную в стерильный пеницил- линовый флакон. Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в холодильник (-70)-(-80)°С.

Анализ выживаемости метанотройюв через 13 мес хранения показывает, что за это время ч жизнеспособность терий полностью сохраняется, загрязнение культуры посторонней микро&ло- рой не наблюдается. Бактерии начинают расти через двое суток после перенесения полоски бумаги на влажную твердую среду или через трое суток при перенесении полоски бумаги в пробирку с жидкой средой.

П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но выращивают культуру Methylocoocus thermophilus, а для хранения используют стекловолокнистую бумагу GF/F. Через 13 мес жизнеспо- собность клеток полностью сохраняется

Прим ер 3. Способ осуществляют по примеру 1, но выращивают культуру Methyl obac tar cnroococcutn, а для хра

с

Q 5

$

0

нения не ПОЛЬЗУЮТ хромлтогр.нЬмчггкую бумагу ватман 3. Жи(неспособность клеток полностью сохраняется в течение 13-14 мес.

П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 1, но выращивают культуру Methy1 осуstis echinoides, а для хранения используют стекловолокнистую бумагу GF/A и хранят при температуре жидкого азота (-196°С). Выживаемость клеток после замораживания сохраняется близкой к 100%.

П р и м е р 5. Pseudomonas stut- zeri BKM В-975 выраидевают в течение суток на МПА при 30° С. Далее способ осуществляют по примеру 1, но хранят при -40°С. Жизнеспособность клеток полностью сохраняется через 14 мес.

П р и м е р 6. Methylophilus glu- coseoxidans BKM B-1607 (ограниченно-факультативный метило- троф) выращивают на минеральной агаризованной (2% агара Дифко) среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: КНгР04 2,0; (NH4)tSO«. 2,0; MgS04- 7H20 0,175; Ре804.7НгО 0,002. рН доводят до 7,2 раствором NaOH, стерилизуют при 1 атм 30 мин. Перед застыванием в стерильную среду вносят 0,5% (об/об) метанола. Выращивание проводят при 30°С. Далее способ осуществляют по примеру 1. Жизнеспособность клеток через 13 мес хранения близка к 100%.

Пример 7. Escherichia coli K802/pILL 435 (lig T4) (продуцент ДНК- лигаэы фага Т4) выращивают на МПА в течение суток при 30 С. Далее способ осуществляют по примеру 1. Через 13 мес жизнеспособность клеток и биохимическая активность сохраняются.

Пример 8. Candida methylica BKM Y-2356 выращивают на сусло-агаре при 29 С в течение суток. Далее способ осуществляют по примеру 1. Выживаемость клеток через 14 мес хранения близка к 100%.

Пример 9. Культуру Streptomy- ces aureofaciens ATCC 10762, NRLL 2209 (продуцент хлортетрациклина) выращивают в течение 2 сут при 29°С на среде, содержащей, г/л: глюкоза 4,0; дрожжевой экстракт 4,0; мальтэкстракт 10,0; агар 12,0, рН 7,2. Для осуществления консервации проводят полоской бумаги по культуре на агаре (снимают реплику), с помощью пинцета переносят бумагу в стерильный флакон, закрывают

герметично проПкои и хранят при (-70) (-80)°С. Жизнеспособность клеток через 8 мес хранения близка к .

Пример 10. Культуры метано- тройных бактерий хранят при (-7П) - (-80) Сна хроматографической бумаге ватман № 1. После хранения при (-70) - (-80)СС в течение двух недель бактериальные клетки выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем помещают их п холодильную камеру на неделю. Цикл замораживание - оттаивание повторяют 6 раз. Клетки сохраняют жизнеспособность не менее 6 циклов оттай- вания - замораживания.

Результаты устойчивости метанотроф ных бактерий к повторным циклам замораживания - оттаивания приведены в табл. 1.f

Таким образом, при хранении предлагаемым способом клетки не теряют жизнеспособность в случае многократного их оттаивания и повторного замораживания .

Пример 11. Для сравнения выживаемости микроорганизмов при использовании известного и предлагаемого способов консервации бактерии выращивают на агаризованной среде в оптимальных для каждой культуры условиях. Бактериальную взвесь в Физиологическом растворе или его смеси с криопротектором, содержащую клеток/мл, или полоски бумаги (GF/A) с нанесенной на них .биомассой, замора- кивают в полиэтиленовых ампулах объемом 2 мл. После кратковременного (15 мин) пребывания в жидком азоте образцы деконсервируют на водяной ба- не при 37 С. Количество выживших бактерий в образцах определяют по числу сформировавшихся микроколоний на агаризованной среде при культивировании в оптимальных условиях. При заморажи-

0

, 105

5 $

5

0

и л ним на бумаг 1 общс % количгстпо ггн1- ток просчитывают посче с успепдирон.ч- ния бактерии с бумаги в стерильную жидкую среду с помощью камеры Гор яг - ва под микроскопом, и количество жизнеспособных клеток определяют после прорашивания полученной суспензии на агаризованной среде по числу колоний. Полученные результаты обрабатывают статистически. Лостоверность расчетов составляет 95%.

В табл. 2 приведены результаты исследований по выживаемости микроорганизмов в процессе консервации известным и предлагаемым способом.

Преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в простоте процедуры консерпа- ции (отсутствие криопротекторов и специальных установок по криоконсерва- ции) при сохранении высокой выживаемости (до 100%) в течение 13-14 мес хранения даже у тех культур микроорганизмов, которые не могли быть законсервированы ни одним из известных способов. Кроме того, предлагаемый способ удобен для хранения культур не только в крупных коллекциях, но и в лабораторных условиях и на производстве.

Формула изобретения

Способ хранения микроорганизмов, предусматривающий выращивание культуры на агаризованной среде и последующее замораживание при температуре от. -40 до -196е С, отличаю - щ и и с я , тем, что, с целью упрощения способа при сохранении или повышении степени жизнеспособности клеток, перед замораживанием культуру помещают на хроматографическую или ь стекловолокнистую бумагу.

Таблица 1

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для хранения в музейных и лабораторных коллекциях культур микроорганизмов. Цель изобретения - упрощение способа при сохранении жизнеспособности клеток. Микроорганизмы, выращенные на агаризованной среде, переносят на полоску хроматографической или стекловолокнистой бумаги и хранят либо в холодильнике при температуре от -40 до -80°С или в жидком азоте при - 196°С. Способ позволяет успешно хранить разные культуры бактерий, актиномицетов, дрожжей. Метанотрофные бактерии и дрожжи предпочтител ьно хранить в холодильнике при температуре (-70) - (-80)°С. Преимущество предложенного способа заключается в простоте криоконсервации при сохранении 100% выживаемости клеток в течение 13 - 14 месяцев, 2 табл.

Methylomonas metha- nica штаммы 12,23, 68

Не менее 6

167168 Н

Продолжение табл.1

Methylobacte r vine- land ii штаммы 30, 87Не менее 6

Methylobacter chroococcum штаммы 72,9)Не менее 6 Methylobacter bo- vis штамм 98 Не менее 6 Methylococcus ther- mophilus штаммы 104, 108,112Не менее 6 Methylococcus cap- sulatus штаммы 113, 114, 120 Не менее 6

Таблица2 МикроорганизмыВыживаемость, % от контроля

Замораживание Замораживание с криопротектором в Лиз. растворе

в физ. на бумаге 10% гли- КЯ ДМСО 12% саха- растворецеринроза

Methylomonas methanica 12 О 98,1±2,1 000

Methylobacillus methanolovorus BKM В-1447Д 0 97,5±3,0 О О О

Metholophilus glucoseoxidans BKM В-1607Д099,1±4,0 000

Mithylobactertum organophilura ATCC 27886 0 100,0 20,1+4,5 23,2+3,2 18,1+3,4

Escherichia coli BKM

В-1449Д 15,9±5,1 100,0 51,,6 60,4+3,6 .58,8-4-2,6.

Bacillus subtilis BKM

B-501T47,1+4,4 100,0 80,3+4,1 79,643,6 76,844,1

Составитель В.Соина Редактор Н.Рогулич Техред М.Дидык Корректор С.Шекмар

ц -т. ...-.- .--. -гт --. - г- -,-«-Г«П- - - - - - - - -

Заказ 2803Тираж 361Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101