Способ подготовки бактерий ЕSснеRIснIа coLI,несущих рекомбинантные плазмиды,для низкотемпературной консервации Советский патент 1988 года по МПК C12N1/04 C12N1/04 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам подготовки бактерий E.coli, в т.ч. содержащих рекомбинатные плазмиды, к низкотемпературной конвервации, и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в молекулярной генетике с целью длительного хранения микробных куль- тур без потери ими жизнеспособности и генетической стабильности.

Целью изебретения является упрощение и удешевление процесса.

Способ заключается в следующем.

Микробную культуру высевают на скошенньй агар, в пробирку с которым вносят примерно 0,2 мл жидкой пита- тельной среды, и выращивают до ста- ционарной фазы роста. Затем к полученной суспензии добавляют 10%-ный раствор глицерина и свежую питательную среду (в соотношении 1:1) до достижения плотности суспензии 10,

10 клеток/мл (контроль по стандарту мутности), после чего в суспензию вносят 10%-ное обезжиренные молоко (реактив фирмы Difco) в соотношении 1:1 и перемешивают. Суспензию охлаж- дают в холодильнике при 4-6 С в течение 4-8 ч, а затем в малой чашке Петри наносят на стерильные гранулы обезвоженного силикагеля (марка КСМГ) Гранулы подсушивают в эксикаторе над поглотителем влаги (силикагель, хлористый кальций, пятиокись фосфора) при 4-6°С в течение 12-13 ч. В пластмассовую стерильную ампулу помещают на дно несколько зерен прокаленного индикатора влажности (силикагель с хлористым кобальтом). Индикатор влажности (синего цвета) покрывают кружком стерильной фильтровальной бумаги В асептических условиях гранулы силикагеля (в количестве 10-20 шт ) .из чашки Петри переносят в ампулу. Поверх гранул помещают небольшой комочек стерильной ваты, после чего завичивают крышку ампулы до упора. Ампу

лы хранят в холодильнике при температурах -40, -70 С или в парах азота при -150, . По мере необходимости из ампулы в асептических условиях извлекают по одной грануле силикагеля и на чашке Петри с соответ ствующей питательной средой произво дят инокуляцию, перемещая гранулу по поверхности питательной среды. Чашку

5

0

5

О ,/ 0 g

50

55

с культурой инкубируют в оптимальных условиях.

Предварительное охлаждение суспензии после добавления протекторов необходимо для адаптации клеточных мембран к последующему замораживанию и обеспечивает лучшую вьскиваемость культуры.

Температура 4-6 С является оптимальной, поскольку при комнатной температуре не достигается охлаждение суспензии, а при выдерживании при отрицательных температурах могут быть повреждены клетки микроорганизмов. Для охлаждения могут быть использованы температуры от О до В С, однако для обеспечения указанных значений необходимы специальные условия, температура 4-6 С обеспечивается обычным бытовым холодильником. Время охлаждения суспензии 4-8 ч является необходимым условием осуществления способа, поскольку при выдерживании менее 4 ч не достигается достаточное охлаждение суспензии и проникновение протектора в клетки. Выдерживание более 8 ч нецелесообразно, так как при наличии того же эффекта осуществление способа займет больше времени.

Охлажденную суспензию необходимо наносить только на гранулы обезвоженного силикагеля, так как процесс ре- гидратации происходит с выделением тепла и, если силикагель не обезвожен, клетки сохранят какое-то количество влаги и хулсе перенесут замораживание.

Установлено, что для достижения положительного эффекта является обязательное подсушивание гранул силикагеля с нанесенной суспензией в присутствии поглотителя влаги. Использование этого приема определяется тем, что при подсушивании происходит обезвоживание клеток перед низкотемпературным хранением. Наиболее полное обезвоживание клеток достигается не менее, чем за 12 ч подсушивания. Более 13 ч клетки подсушивать нецелесообразно, поскольку эффект достигает- . ся тот же. Требования к поддержанию температуры те же, что и при выдерживании суспензии перед нанесением на гранулы.

Помещение гранул в герметически закрывающиеся ампулы в присутствии индикатора влажности необходимо для обеспечения контроля за условиями хранения культуры в обезвоженном состоянии.

Пример 1. Культуру Escherichia coli, содержащую рекомбинатную ДНК | (Pst-I - фракция тотальной ДНК человека в плазмиде pBR 322) - клон pBR 13 выращивают на агаризованной среде LB в присутствии тетрациклина. Выращи-, вание проводят в течение 18 ч при ю 37 С на скошенном агаре с добавлением среды LB, Затем к полу.ченной суспензии добавляют 10%-ный раствор глицерина и Свежую питательную среду LB в CQСохранение селективных маркеров устойчивости к антибиотикам проверяют следующим образом. В лунки репликатора помещают суспензию, содержащую десорбированные с носителя клетки, объемом 10 мкл. Затем делают отпечатки на поверхность питательной среды в двух чашках Петри, содержащих и не содержащих антибиотик. Через 24 ч инкубирования ПОДСЧИТЫВАЮТ число коло1 М до достижения плотности ,5 „ий, выросших на каждой из чашек.

/.,„ TJ . Данные по числу колоний на селекотношении

суспензии 10 клеток/мл. В суспензию вносят 10%-ное обезжиренное молоко в соотношении 1:1 и перемешивают. Суспензию охлаждают в холодильнике при 4-6 С в течение 4 ч, а затем в чашке Петри наносят ,на стерильные гранулы обезвоженного силикагеля. Гранулы подсушивают в эксикаторе над осушителем (хлористый кальций) при 4-6 С в течение 12 ч. В пластмассовую стерильную ампулу (фирма Нунк) помещают на дно несколько зерен прокаленного индикатора влажности (сили- кагель с хлористым кобальтом), покрывают его кружком стерильной фильтровальной бумаги. В асептических условиях гранулы силикагеля (20 шт.) переносят в ампулу. Поверх гранул помещают небольшой комочек стерильной ваты, после чего завинчивают крьшку ампулы до упора, мпyлы хранят при температуре -70°С. Через 28 мес хранения проводят контроль жизнеспособности клона pBR 322. Для этого в стерильных условиях извлекают гранулу и перемещают «ее по поверхности питательной среды (агаризованный LB) в чашке Петри, после чего чашку с культурой инкубируют в течение 24 ч при . На поверхности среды отмечают рост культуры по следу перемещения гранулы.

Так же проводят количественный учет жизнеспособности клеток клона pBR 13. Для этого гранулу помещают в пробирки с 1 мл стерильной воды и встряхивают в течение 5 мин на приборе Vortex - ginie, после чего делают посев десорбированных клеток (100 мкл суспензии на чашку Петри). После инкубирования подсчитывают число колоний. Через 28 мес хранения выживаемость клона составляет 4,1%, при этом после лиофилизации жизнеспособность

20

25

35

тивной и не, селективной среде досто верно не различаются, что свидетель ствует о 100%-ном сохранении плазмиды в штамме-хозяине в процессе хранения.

Сохранение фрагмента ДНК-человека в плазмиде определяют путем электрофореза рестриктных фрагментов в агарозном геле. Было показано наличие фрагмента ДНК.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1,. однако выращивают клон pHS 35, содержащий 2Q рекомбинатную ДНК (Pst 1 фрагмент геномной ДНК человека), втроенную в плазмиду pKN 001 и введенную в штамм E.coli НВ101. Суспензию охлаждают при 4-6 С в течение 8 ч, затем наносят на гранулы обезвоженного силикагеля и подсушивают при 4-6 С в течение 13 ч, помещают в герметически закрываю чиеся ампулы, которые хранят при -70 С. Жизнеспособность клона pHS 35 через 28 мес хранения составляет 2,6%, после лиофилизации и криоконсервации .эта величина соответственно равна 0,96 и 20%. Гететичес- кую стабильность клона оценивают по сохранению селективного признака устойчивости к антибиотику, кодируемому .геном в составе векторной плазмиды, сохранению сайтов рестрикции Pst-1 в рекомбинантной ДНК и исходной длины клонированного в векторе Pst-1 фрагмента ДНК человека.

Параллельное определение титра жизнеспособных клеток на питательных средах, содержащих и не содержащих антибиотик, показывает 100%-ное наличие маркера устойчивости к тетрациклину .

Анализ длин рестриктных .Pst-1 фрагментов плазмидной ДНК, выделен40

45

50

55

клона была на уровне 2%, а после крио- консервации в процессе хранения жизнеспособность потеряна.

Сохранение селективных маркеров устойчивости к антибиотикам проверяют следующим образом. В лунки репликатора помещают суспензию, содержащую десорбированные с носителя клетки, объемом 10 мкл. Затем делают отпечатки на поверхность питательной среды в двух чашках Петри, содержащих и не содержащих антибиотик. Через 24 ч инкубирования ПОДСЧИТЫВАЮТ число коло„ий, выросших на каждой из чашек.

0

5

5

тивной и не, селективной среде досто верно не различаются, что свидетель ствует о 100%-ном сохранении плазмиды в штамме-хозяине в процессе хранения.

Сохранение фрагмента ДНК-человека в плазмиде определяют путем электрофореза рестриктных фрагментов в агарозном геле. Было показано наличие фрагмента ДНК.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1,. однако выращивают клон pHS 35, содержащий Q рекомбинатную ДНК (Pst 1 фрагмент геномной ДНК человека), втроенную в плазмиду pKN 001 и введенную в штамм E.coli НВ101. Суспензию охлаждают при 4-6 С в течение 8 ч, затем наносят на гранулы обезвоженного силикагеля и подсушивают при 4-6 С в течение 13 ч, помещают в герметически закрываю чиеся ампулы, которые хранят при -70 С. Жизнеспособность клона pHS 35 через 28 мес хранения составляет 2,6%, после лиофилизации и криоконсервации .эта величина соответственно равна 0,96 и 20%. Гететичес- кую стабильность клона оценивают по сохранению селективного признака устойчивости к антибиотику, кодируемому .геном в составе векторной плазмиды, сохранению сайтов рестрикции Pst-1 в рекомбинантной ДНК и исходной длины клонированного в векторе Pst-1 фрагмента ДНК человека.

Параллельное определение титра жизнеспособных клеток на питательных средах, содержащих и не содержащих антибиотик, показывает 100%-ное наличие маркера устойчивости к тетрациклину .

Анализ длин рестриктных .Pst-1 фрагментов плазмидной ДНК, выделен0

5

0

5

51 А/,2544

кой после хранения колоний клона pHS 35 в агароэном геле, показывает полсоpH

ную идентичность структуры рекомбиП р и м е р 6. Культуры E.coli, содержащие рекомбинантные ДНК, клон pHS 35, готовят к консервации аналонантной ДНК (наличие двух сайтов рест-п гично примеру 2, но хранение ампул

Он г /

рикции Pst-1, длина векторной молекулы около 12 тыс. пар нуклеотидов и длина вставочного Pst-1 фрагмента 990 пар нуклеотидов) до и после хранения.10

Таким образом, уровень жизнеспособности клеток при хранении на носителе хотя и ниже, чем при использовании криоконсервации, однако вполне удовлетворителен (титр клеток 10 клеток 15 /мл) для проведения любых исследований с данным клоном. При этом на хранение помещают в три раза больше образцов (в тех же единицах хранения осуществляют при температуре -150 С. )(изнеспособность клона pHS 35 через 28 мес хранения составляет 2,9%. Выбор температур хранения -70 и -150 С обусловлен возможностями использования низкотемпературных холодильников обеспечивающих термостатирование на уровне -70 С и биохранилищ типа ХБ- 0,5 с жидким азотом, где культуры микроорганизмов в пластмассовых амО

пулах хранят в парах азота при-150 С Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он обеспечивает высокий уровень жизнеспособпозволяет хранить клоны с любыми , типами вставок. Проверка генетической стабильности штаммов с рекомбинантны ми плазмидами показала, что в продес

ампулах), чем при использовании крио- 20 культур в процессе хранения и консервации.

П р и м 8 р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но для хранения используют штамм E.coli НВ101, несущий плазмиду pBR 325 с. маркерами устойчи- - 5 се хранения сохраняются селективные вости к антибиотикам: хлорамфениколу, маркеры устойчивости к антибиотикам, ампициллину, тетрациклину, и штамм E.coli Сбор, несущий плазмиду pVC 18 с маркером устойчивости к ампициллину.

30

Через 1 год хранения выживаемость щтаммов составляет 100%. При высеве на селективную среду с описанными антибиотиками выживаемость культур достоверно не отличается от этого показателя, полученного при использовании неселективной среды, что свидетельствует о том, что штаммы сохраняют плазмиды.

П р и м е р 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но хранят штаммы E.coli МС1009, LE 392, МН1, НВ101, СбОО, Выживаемость штаммов через 1 год хранения составляет 20-50%, что соответствует титру клеток/ /мл.

а также сайты рестрикции. Кроме того предлагаемый способ по сравнению с известными характеризуется простотой и доступностью осуществления, сокращением времени на подготовку образцов, экономией ампул и расширением спектра микробных культур, подлежащи хранению.

Формула изобретен и я

35 Способ подготовки бактерий Escherichia coli, несущих рекомбинантные плазмиды, для низкотемпературной кон ;ервации,, предусматривающий выращива ние их в жидкой питательной среде до

40 стационарной фазы роста, приготовление суспензии клеток плотностью 10 клеток/мл, добавление в нее 1б -ного раствора глицерина в качестве криопротектора с последующей

45 консервацией суспензии при низких температурах, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, в качестве криопротектора при высушивании клеток дополнительно используют 10%-ное обезжиренное молоко, затем суспензию клеток охлаждают при 4-6 С в течение 4-8 ч и наносят на гранулы обезвоженного силикагеля с последуюП р и м е р 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но культуру Е. coii, содержащую рекомбинантную ДНК (Pst-1-фракция тотальной ДНК человека в плазмиде pBR 322 - клон pBR 13), после нанесения на обезвоженный сили- кагель и помещения в герметически завинчивающиеся ампулы хранят в парах азота при температуре -150 С. Через 1 год хранения проводят учет числа жизнеспособных клеток путем посева на плотную питательную среду. Выживаемость клона 5,9%.

П р и м е р 6. Культуры E.coli, содержащие рекомбинантные ДНК, клон pHS 35, готовят к консервации аналон г /

осуществляют при температуре -150 С. )(изнеспособность клона pHS 35 через 28 мес хранения составляет 2,9%. Выбор температур хранения -70 и -150 С обусловлен возможностями использования низкотемпературных холодильников, обеспечивающих термостатирование на уровне -70 С и биохранилищ типа ХБ- 0,5 с жидким азотом, где культуры микроорганизмов в пластмассовых амО

пулах хранят в парах азота при-150 С. Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он обеспе. чивает высокий уровень жизнеспособпозволяет хранить клоны с любыми , типами вставок. Проверка генетической стабильности штаммов с рекомбинантны- ми плазмидами показала, что в продесно ти культур в процессе хранения и

се хранения сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам,

се хранения сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам,

а также сайты рестрикции. Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с известными характеризуется простотой и доступностью осуществления, сокращением времени на подготовку образцов, экономией ампул и расширением спектра микробных культур, подлежащих хранению., Формула изобретен и я

Способ подготовки бактерий Esche richia coli, несущих рекомбинантные плазмиды, для низкотемпературной кон- ;ервации,, предусматривающий выращивание их в жидкой питательной среде до

стационарной фазы роста, приготовление суспензии клеток плотностью 10 клеток/мл, добавление в нее 1б -ного раствора глицерина в качестве криопротектора с последующей

консервацией суспензии при низких температурах, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, в качестве криопротектора при высушивании клеток дополнительно используют 10%-ное обезжиренное молоко, затем суспензию клеток охлаждают при 4-6 С в течение 4-8 ч и наносят на гранулы обезвоженного силикагеля с последуюЩим подсушиванием в присутствии поглотителя влаги при 4-6 С в течение 12-13 ч, после чего гранулы помещают в герметически закрывающиеся ампулы и хранят при -70 С или -15Q С.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам подготовки бактерий, содержащих рекомби- нантные плазмиды, к низкотемпературной консервации, и может быть использовано в микробиологической промыш- леннос ти, а также в молекулярной генетике с целью длительного хранения микробных культур без потери ими жиз- / неспособности и генетической стабильности. Целью изобретения является упрощение процесса, а также расширение спектра микробных культур, подлежащих хранению, при обеспечении их оптимальной жизнеспособности и генетической стабильности. Способ заклю чается в том, что бактерии Escheri- chia coli, несущие рекомбинантные плазмиды, выращивают в жидкой питательной среде до стационарной фазы роста, готовят суспензию клеток плотностью 10-10 клеток/мл, добавляют в нее 10%-ный раствор глицерина в качестве криопротектора и 10%-ное обез- g жиренное молоко /реактив фирмы Difco) в соотношении 1:1, перемешивают и . охлаждают при температуре 4 - 6 С в течение 4-8 ч, после чего наносят на гранулы обезвоженного силйкагеля S с последующим подсушиванием при 4-6 Ci в течение 12-13 ч.в присутствии погло| тителя влаги, а затем гранулы помещают в герметически закрывающиеся ам-| пулы. Предлагаемый способ обеспечивает высокий уровень жизнеспособности культур в процессе хранения, позволя- ет хранить клоны е любыми типами вставок, при этом сохраняются селективные маркеры устойчивости к антибиотикам, а также сайты рестрикции. СО