Способ иммунологической диагностики туберкулеза Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к методам иммунодиагностики туберкулеза.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Антиген - гликопептид клеточной оболочки микробактерий БЦЖ фиксируют на полистероловых круглодонных 96-луночных планшетах в количестве 20 мкг/мл или 2 мкг на 100 мкл на лунку в карбонат-бикарбонат- ном буфере рН 9,6 в течение 16-24 ч при 4°С. По окончании сорбции раствор антигена удаляют сильным встряхиванием, после чего планшет закрывают крышкой, герметично заклеивают лейкопластырем и хранят при 4°С до 6 мес без потери биологической активности.

Перед постановкой реакции планшет отмывают три раза фосфатно-солевым буфером 0,1 М рН 7,2, содержащим 0,05% твин-20.

Готовят основные разведения исследуемых сывороток больных 1:200 на фосфат- но-солевом буфере 0,1М рН 7,2, содержащем 0,05% твин-20 Растворы анализируемых сывороток в количестве 100 мкл вносят в трех порциях в лунки планшета. Обязательно на каждом планшете ставят контрольные сыворотки - положительную и отрицательную. Планшет выдерживают в термостате при 37,5°С в течение 60 мин, после чего жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают кзк описано.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл пероксидазного конъюгата в рабочем разведении1:500, которое устанавливают

О VI

ю W о

00

предварительным титрованием конъюгата каждой серии. Планшеты выдерживают при 37°С 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстрат доводят до рН 5,9-6,0 0,1N NaOH. Субстратную смесь готовят непосредственно перед заполнением лунок путем соединения субстрата и перекиси водорода в соотношении 10:1. Субстрат - 0,08%-ная 5-аминосалициловая кислота - готовят на дистиллированной воде, подогретой до 65°С. После охлаждения до 20°С устанавливают рН 5,9%6,0 с помощью 0,1N NaOH. Затем вносят по 10 мкл в лунку и выдерживают в течение 60 мин в защищенном от солнца месте. Результат реакции учитывают инстоументально на энзиметре - вертикальном спектрофотометре типа Мультискан на длине волны 450+3 нм. Вычисляют среднее значение из трех параллельных определений для каждой сыворотки. В каждом планшете ставят контрольную положительную и контрольную отрицательную (выделенную из крови донора) сыворотки. Результат анализа указывает на туберкулез, если экстинция исследуемой сыворотки превышает таковую в отрицательном контроле на 0,2. Чистое время проведения способа занимает С ч.

Для получения гликопептида 1,0 г сухого веса клеточных оболочек БЦЖ экстрагируют 10 мл 13%-ного, тритона Х-100 на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20-30 мин. Над- осадочную жидкость по каплям вливают в 100 мл ацетона и оставляют на 20 ч для формирования осадка, затем ацетон над осадком удаляют и осадок центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. Полученный осадок промывают 2 раза эфиром и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Осадок сушат в термостате. К сухому осадку добавляют постепенно 3 мл физиологического раствора, оставляют на ночь в холодильнике для лучшего экстрагирования, затем центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин, К осадку добавляют 1 мл физиологического раствора, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин. Над- осадочные жидкости первого и второго центрифугирования объединяют и получают фракцию гликопептида.

Пример. Больной К. поступил в диагностическое отделение с подозрением на инфильтративный туберкулез легких или острую пневмонию. Бактериоскопия мокроты не выявила микобактерий туберкулеза. Иммунологическое исследование не дало точного ответа на этиологический фактор заболевания.

У этого больного берут 2,5 мл крови, из которой общепринятым способом получают 1 мл сыворотки и проводят определение антител к гликопептиду клеточной оболочки в

ИФА. Для этого планшет, сенсибилизированный данным антигеном в дозе 2 мкг на лунку и хранившимся при 4°С, был отмыт 3 раза 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,05%-ный твин-20. Разведения

0 исследуемых сывороток 1:200 на том же буфере в количестве 100 мкл наносят на три параллельные лунки планшета. В таком же разведении поставили контрольные положительную и отрицательную сыворотки в

5 трех параллельных лунках. Планшет выдерживают в термостате при 37,5°С в течение 60 мин. Затем жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают как описано. Затем во все лунки вносят по 100 мкл фер0 ментного пероксидазного конъюгата, изготовленного в разведении 1:500. Планшеты выдерживают при 37,5°С в течение 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 100 мкл субстратной смеси, приготовленной со5 единением субстрата и перекиси водорода

в соотношении 10:1. При этом субстрат

.(0,08%- ную 5-аминосалициловую кислоту)

готовят на дистиллированной воде, подо1

гретой до 56°С. После охлаждения до 20°С

0 устанавливают рН до 5,9-6,0 с помощью 01 NaOH. Планшеты выдерживают 60 мин в защищенном от света месте. Результат реакции учитывают инструментально на вертикальном спектрофотометре типа

5 Мультискан при длине волны 450+0,3 нм, вычисляют среднее значение из трех параллельных разведений каждой сыворотки, включая контрольные.

Экстинция исследуемой сыворотки

0 (0,597) превышает таковую в отрицательном контроле (0,085), на 0,512, т.е. разница выше 0,2, что указывает на наличие у данного больного туберкулеза.

С помощью предлагаемого способа вы5 явление больных туберкулезом увеличивается на 4% по сравнению с известным(94% больных выявляются предлагаемым способом и только 90% известным) и на 4% возрастает точность способа (у здоровых доноров

0 только в 1 % наблюдается ложноположитель- ных проб при использовании предлагаемого способа и 5% - известного).

Формула изобретения Способ иммунологической диагности5 ки туберкулеза, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее в ячейках микропланшета,сенсибилизированных антигеном, с последующим выявлением количества антител с помощью иммунофер- ментного анализа по оптической плотности,

отличающийся тем, что, с цельюного разводят 1:200 и при увеличении оптиловышения точности способа, в качествеческой плотности в пробе с сывороткой

антигена используют гликопротеид клеточ-больного по сравнению с пробой сыворотки

ной стенки туберкулезной бактерии штаммаот здоровых более чем на 0,2 единицы диагБЦЖ, а перед инкубацией сыворотку ностируют туберкулез.

Изобретение относится к медицине, а именно к методам иммунодиагностики туберкулеза. Цель изобретения - повышение точности способа. Предварительно из туберкулезного микроба (штамм БЦж) выделяют гликопротеид, который используют в качестве антигена. У больного берут кровь, выделяют сыворотку, которую разводят 1:200 и вносят в микроячейки плата, сенсибилизированные антигеном, параллельно с разведенной сывороткой здоровых. После чего проводят иммуноферментный анализ и определяют оптическую плотность в обеих пробах и при увеличении ее значения в пробе с сывороткой крови больного по сравнению с пробой с сывороткой здоровых более чем на 0,2 единицы диагностируют туберкулез. Достигается увеличение точности на 4%.