Способ определения ассоциированного с беременностью протеина-А Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, биологии, а именно к биохимии и иммунологии, и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, онкологии при определении концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в рэз- личных биологических жидкостях и экстрактах тканей.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа, а также сокращение времени анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

В каждую лунку полистиролового планшета вносят 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) гепарина в забуференном фосфатами физиологическом растворе с рН 7,0 и инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С. После сенсибилизации лунок и в дальнейшем планшеты промывают забуфвренным фосфатами

физиологическим раствором с рН 7,4, содержащим 0,1 %-ный твин-20, не менее трех раз. Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят по 0,2 мл 1 %-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубируют 30 мин при 37°С. Затем лунки промывают.

Калибровочные разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женщин с известной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А вносят в лунки двух рядов с дублированием каждого разведения. Исследуемые образцы биологических жидкостей или экстрактов тканей помещают в остальные лунки планшета, Обьем антигенсодержащих растворов составляет 0,2 мл. Инкубацию проводят в течение 1 ч при 37°С. После инкубации и

OV

VI

СЛ

VI

VI

00

отмывки планшета в лунки вносят по 0,2 мл раствора кроличьих моноспецифических аффинно очищенных антител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуферном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) в концентрации 40 мкг/мл и инкубирут планшет в течение 2 ч при 37°С, затем планшет отмывают.

В лунки вносят по 0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов кролика, конъю- гированных с пероксидазой из хрена, в рабочем разведении 1:1000 в забуференном фосфатами физиологическом растворе, рН 7,4, и выдерживают в течение 1,5 ч при 37°С, после чего планшет промывают. Затем в лунки вносят 0,15 мл субстратного раствора рН 5,0(0,05 М лимонной кислоты, 0,1 М двухзамещенного фосфата натрия, 0,04%-ного ортофенилендиамина и 0,012%-ной перекиси водорода). Ферментативное окисление субстрата при участии иммобилизованной пероксидазы из хрена проводят в течение 30 мин при 20°С с защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 М серной кислоты. Относительную оптическую плотность содержимого каждой лунки определяют спектрофотометрически при длине волны 492 нм по отношению к контрольным лункам, в которые вместо антигенсодержа- щих растворов вносят забуференный фосфатами физиологический раствор (рН 7,4).

П р и м е р 1. Проводили определения концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в сыворотке крови небеременной женщины М., 28 лет, донора со станции переливания крови. Предварительно в лунки планшета вносят 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) гепарина в забуферном фосфатами физиологическом растворе (хлористый натрий 8 г, однозамещенный фосфат калия 0,2, двузамещенный фосфат натрия 2,9, хлористый натрий 0,2, дистиллированная вода до 1000 мл) с рН 7,0 и инкубируют его 1,5 ч при 37°С. Для промывки лунок используют забуференный фосфатами физиологический раствор с рН 7,4, содержащий 0,1%-ный твин-20, причем промывку производили на этом этапе и в дальнейшем троекратно.

Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят 0,2 мл 1 %-но- го раствора бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубировали 30 мин при 37°С. Затем лунки промывают. Для построения калибровочного графика в 9 лунок двух рядов вносят разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женщин (II триместр беременности) с исходной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А 80 мкг/мл, измеренной с помощью методов количественного иммуноэлектрофореза.

Разведения смеси сывороток в забуфе- реннсм фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) были следующими, нг/мл: 2000; 1000:200; 100; 20; 10; 2; 1; 0,5. В лунки

0 их вносят в обьеме 0,2 мл. В две лунки этого же планшета вносят по 0,2 мл сыворотки донора М., а еще в две лунки вносят по 0,2 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4) и используют по5 следние в качестве контроля. Инкубацию антигенсодержащих и контрольных растворов проводят в течение 1 ч при 37°С.

После инкубации и отмывки в рабочие лунки вносят по 0,2 мл раствора кроличьих

0 моноспецифических афинно очищенных антител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) в концентрации 40 мкг/мл и оставляют

5 планшет на 2 ч при 37°С, проводят отмывку планшета. Затем в рабочие лунки вносят по 0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой из хрена в разведении 1:1000 в

0 забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и выдерживают 1,5 ч при 37°С, после чего планшет промывают. Затем в рабочие лунки вносят по 0,15 мл субстратного раствора, рН 5,0 (0,05 М ли5 монной кислоты, 0,1 М двухзамещенного фосфата натрия, 0,04%-ного ортофенилендиамина и 0,012%-ной перекиси водорода). Эту стадию ферментативного окисления субстрата при участии иммобилизованной

0 перрксидази из хрена1 проводят в течение 30 мин при 20°С в защищенном от света месте.

Оптическую плотность содержимого каждой лунки, в которую вносили калибро5 вочные разведения стандартной смеси сы- аороток и сыворотка крови исследуемого донора, определяют при длине волны 492 нм по отношению к контрольным лункам, в которые вносился забуференный фосфата0 ми физиологический раствор (рН 7,4). Получены следующие значения относительной оптической плотности (в единицах оптической плотности) для калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,728,0,722; 1000 нг/мл 5 0,677, 0,674; 200 нг/мл - 0,530, 0,533; 100 нг/мл - 0,479,0,480; 20 нг/мл - 0,382,0,383; 10 нг/мл - 0,338, 0,338; 2 нг/мл - 0,216, 0,215; 1 нг/мл - 0.174. 0,174; 0,5 w/мл - 0,050,0,051. На основании этих данных был построен калибровочный график, отражающий зависимость между относительной оптической плотностью содержимого лунок м соответствующей концентрацией в них ассоциированного с беременностью протеи- на-А. Относительная оптическая плотность содержимого лунок, в которые вносилась сыворотка крови женщины - донора, составила 0,404; 0,409, что соответствует на калибровочном графике концентрации ассоциированного с беременностью проте- ина-А 38,0 и 38,2 иг/мл, среднее значение результатов анализа 38,1 нг/мл. Продолжительность всего анализа равнялась 7 ч.

П р и м е р 2. Проводят измерение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в мо -.е беременной Н., 28 лет, 30 недель беременности. Предварительно мочу центрифугируют и фильтруют. Все дальнейшие этапо анализа и их продол- жительность аналогичны примеру 1. Получены следующие значения относительной оптической плотности для калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,719, 0,728; 1000 нг/мл - 0,675, 0,679; 200 нг/мл - 0,529, 0,531; 100 нг/мл - 0,490, 0,490; 20 нг/мл - 0.384.0,379; 10 нг/мл -0,342, 0,346; 2 нг/мл - 0,210, 0,211; 1 нг/мл - 0,170, 0,170; 0,5 нг/мл - 0,048, 0,049. На основании этих данных был построен калибровочный график. Относительная оптическая плотность содержимого лунок, в которые вносилась моча беременной Н.. о.-ззалась 0,355 и 0,356, что соответствует концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 15.6 нг/мл.

П р и м е р 3. Приводили определение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте яичниковой ткани, взятой у больной М., 31 г., оперированной по поводу поликистоза яичников. Предварительно кусочек яичниковой ткани массой 0,5 г гомогенизировали в присутствии 1,5 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4), содержащего соевый ингибитор трипсина в концентрации 10 мкг/мл, затем гомогента поместили на 18 ч в холодильную камеру при 4°С, после этого его отцентрифугироза- ли, а супернатант профильтровали для полного отделения от фрагментов ткани. Все

дальнейшие этапы анализа и их продолжительность соответствовали примеру 1. Получены следующие значение относительной оптической плотно ти (в единицах оптической плотнос м) для калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,718, 0,724; 1000 нг/мл - 0,680, 0,670; 200 чг/мл - 0,541, 0,538; 100 нг/мл - 0,482, 0,481; 20 нг/мл - 0,378, 0,380; 10 нг/мл - 0,342, 0,342; 2 нг/мл - 0,210,

0,212; 1 нг/мл - 0,179, 0,176; 0,5 нг/мл - Q.048, 0,050. На основании этих данных был построен калибровочный график. Относительная плотность содержимого лунок, в которые вносится экстракт яичниковой ткани,

равнялась 0,244 и 0,250, что соответствует на калибровочном графике концентрациям ассоциированного с беременностью протеина-А 3,9 и 4,0 нг/мл. После усреднения результатов двух параллельных исследований находим, что концентрация ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте яичника ткани, взятой у больной М., равняется 3,95 нг/мл.

Использование изобретения существенно расширяет возможности применения иммуноферментного метода в широкой клинической и нэучно-исследовательской практике. Достигнуто значительное (в 20 раз) повышение чувствительности иммуноферментного способа определения концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в различных биологических жидкостях и экстрактах тканей. По известному способу чувствительность составляет

10 нг/мл. а по предлагаемому 0,5 нг/мл. Это сочетается с десятикратным сокращением времени проведения анализа (по известному длительность анализа составляет 72 ч, а по предлагаемому способу 7 ч).

Формула изобретения

. Способ определения ассоциированного с беременностью протеина-А путем иммуноферментного анализа с использованием сенсибилизированной твердой подложки и

определением концентрации протеина-А по величине оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, твердую подложку сенсибилизируют гепарином.

Изобретение относится к медицине, биологии, а именно к определению ассоциированного с беременностью белка протеина-/6 в различных биологических жидкостях и экстрактах ткани. Цель изобретения - повы- шекие чувствительности и сокращение времени анализа. 8 каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл раствора гепарина (15 мкг/мл), инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, отмывают. Затем вносят разведение исследуемого материала, инкубируют, отмывают. В дальнейшем инкубируют со специфическими антителами с последующим определением концентрации белка путем соотношения оптической плотности s опытной пробе с калибровочными В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность способа в 20 раз, а длительность анализа сокращается в 10 раз.