Способ определения антигена в растворе Советский патент 1992 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к иммуноферментным способам специфических белковых и небелковых антигенов в пробе плазмы крови, и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики различных патологических состояний.

Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно антитела, вступающие в иммунную реакцию, метят пероксидазой. Образованный комплекс антиген-антитело, меченный пероксидазой, подвергают взаимодействию с хромогеном - о-фенилендиа- мином в присутствии перекиси водорода, останавливают реакцию кислотой и по оптической плотности окрашенного раствора оп- ределяют концентрацию антигена в

исследуемой пробе, причем взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют при 492 нм.

Пример 1. Определяемым антигеном является миоглобинспецифический белок, входящий в состав мышечных клеток. Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к миоглобину и 1 %-ной лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при -10°С. В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов ми- оглобина - стандарта (от 1,25 до 160. нг/мл). Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу сыворотки крови, разведенную в 10 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2. Растворы миоглобина-стан

00

чэ

дарта и пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После отмывки водой в каждую лунку добавляли по 150 мкл разведенные 1:500 меченные пероксидазой антитела к миоглобину человека в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Полученный комплекс миог- лобин-антитело к миоглобину (комплекс антиген-антитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментативной активности. Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мл субстратной смеси, содержащей о-фенилендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 мин. Затем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ-1000, излучающую свет через светофильтры типа ШС-4 СС5. Спаренные светофильтры этого типа позволяют пропускать свет лампы только в диапазоне длин волн от 420 до 460 нм. Облучение реакционной смеси при 420-460 нм производили до получения окраски растворов в лунках планшета. После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали добавлением в них по 50 мкл 50% серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови. Ее значение составило 56,8+2,7 нг/мл.

Пример 2. Определяли гаптен-меди- атор симпатической нервной системы но- радреналин. Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к норадреналину и 1 % лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при 10°С. В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов норадреналина-стандарта (от 0,05 до 50 нг/мл). Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу крови, разведенную в 5 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2, затем добавляли в лунки по 50 мкл разведенный 1:100 меченный пероксидазой норадреналин и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Полученный комплекс норадреналин-анти- титела к норадреналину (комплекс антиген- антитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментативной активности. Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей о-фенйлендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без

доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 мин., Затем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ-1000, излучающую свет через светофильтры типа ШС-4 +СС5 в диапазоне

от 420 до 460 нм. Облучение реакционной смеси светом при 420-460 нм производят до получения окраски растворов в лунках планшета. После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали

добавлением в них по 50 мкл 50% серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию норадреналина в испытуемой плазме крови. Ее значение составило 2 нг/мл.

Помимо плазмы крови в качестве биологического объекта определения концентрации антигена предлагаемым способом может быть использована сыворотка крови или цельная кровь.

Чувствительность (минимальный порог

определения) предлагаемого способа составляет 1,25 нг/мл, вто время как для способа-прототипа чувствительность составляет около 10 нг/мл. По статистическим данным коэффициент вариации для

предлагаемого способа в 3,3 раза меньше, чем для прототипа. Это свидетельствует о повышенной точности предлагаемого способа.

Формула изобретения

Способ определения антигена в растворе путем взаимодействия комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с хромогеном - о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода, остановки реакции кислотой, фотометрирования при 492 нм и определения концентрации антигена по оптической плотности исследуемой пробы, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности

способа, взаимодействие фермента с субстратом осуществляют в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм до появления окраски.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии,, и может быть использовано для определения антигенов в крови. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа. Для этого антиген определяют в реакции ферментсуб- стратного взаимодействия, при этом взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиа- мином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют.