Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови Советский патент 1991 года по МПК G01N33/536 

1Л

С

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической и теоретической иммунологии для определения иммунных комплексов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение точности определения крупных иммунных комплексов, их относительного количества и размеров. Цель достигается тем, что осаждение макромолекулярных структур производят раствором полиэтиленгликоля в конечной концентрации 0,1 - 0,5%, регистрацию осуществляют по измерению спектра оптического смешения света, рассеянного пробой до и после осаждения. Размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинамическому радиусу. О количестве крупных иммунных комплексов судят по изменению оптической плотности раствора. 5 табл.

Изобретение относится к медицине, иммунологии и может быть использовано при изучении патогенеза различных заболеваний.

Цель изобретения - повышение точности способа и обеспечение возможности одновременно регистрировать распределение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) по размерам.

Цел. достигается тем, что согласно известному способу определения размеров ЦИК в сыворотке коови путем их осаждения и последующей регистрации осаждение макромолекулярных структур производят раствором ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,5%. а регистрацию осуществляют измерением спектра оптического смещения .света (СОСС), рассеянного пробой до и после осаждения, причем размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинамическому радиусу, а о количестве крупных ЦИК судят по изменению их относительного вклада в рассеивание света и изменению оптической плотности раствора,

Способ осуществляют следующим образом.

К исследуемой сыворотке крови добавляют растеор ПЭГ 6000 в количестве, эквивалентном количеству исследуемой сыворотки (а данном случае 0,2 мл), с тем. чтобы конечная концентрация ПЭГ составила 0,1-0,5%. После добавления ПЭГ сыворотку оставляют на 24 ч при 22--24°С. затем исследуемые образцы центрифугируют ори 6000 об/мин в течение 30 мин, После центрифугирования супернатант раэгодят 0,9%-ным физиологическим раствором в 25 раз и помещают исследуемую жидкость в количестве 0.5 MI в кювету. Сравнение производит с сывороткой крови, к. которой вместо ПЭГ 6000 добавпяют

такое же количество (0,2 мл) физиологического раствора, после чего также выдерживают 24 ч при 22-24°С, центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и разводят супернатант в 25 раз. После этого помещают раствор в количестве 0,5 мл во вторую кювету.

Измеряют СОСС по гетеродинной схеме и по полученным гистрограммам раствора без ПЭГ и с ПЭГ, сравнивая их, определяют изменение относительного вклада крупной компоненты, а также следят за степенью агрегационных изменений в растворе под действием ПЭГ. Одновременно определяют средний размер по системе (гидродинамический радиус) этой крупной компоненты, по которому можно судить о размере крупных ЦИК, и проводят измерение оптической плотности раствора по известному способу для количественной характеристики содержания крупных ЦИК в сыворотке крови.

Пример 1.Из 4-х больных хроническим активным гепатитом крупные ЦИК размером 3500 нм с относительным вкладом в рассеивание света 30% в количестве, соответствующем 150 ед. оптической плотности (ОП), были обнаружены толькоу одного больного, причем именно у этого больного отмечалось наиболее тяжелое течение заболевания. В то же время контрольное применение известного метода определения ЦИК выявило лишь незначительную разницу в ОП растворов. Данные приведены в табл.1.

Пример 2, Установлено, что при использовании раствора ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,5% осаждаются именно крупные ЦИК, не внося значимых изменений в исследумый образец.

Распределение белковых частиц в сыворотке крови по размерам и относительному вкладу в рассеивание света, в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000, у больного хроническим гепатитом приведено в табл.2.

Как видно из табл.2, начиная с концентрации ПЭГ 6000 1%, вновь увеличивается вклад крупных частиц. Минимальные изменения в составе частиц, позволяющие выделить крупные ЦИК, наблюдаются при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1- 0,5%.

Отсутствие значительных возмущений в сыворотке крови при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1-0,5% контролировали не только по изменению вклада частиц в рассеивание света, но и путем определения общего содержания белка, отдельных фракций и содержания основных классов иммуноглобулинов.

Общее содержание белка в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.3.

Содержание иммуноглобулинов класса

А, М, G в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.4.

Как видно из приведенных данных, минимальные изменения наблюдаются при

концентрации ПЭГ 6000 0,02-0,5%, в то время как дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ 6000 приводит к значительному изменению количественных соотношений как иммуноглобулинов, так и

общего белка.

Изменение ОП растворов в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.5.

При определении ОП раствора при использовании высоких концентраций ПЭГ 6000 изменение ОП происходит за счет изменения общего количества белка (см. табл.3).

При исследовании 100 проб от больных

хроническим вирусным гепатитом по извет- ному способу ЦИК были обнаружены у 90% больных, причем их уровень в сыворотке крови составлял в среднем 0,184±0,04 ед. ОП. В то же время предлагаемый способ

позволял установить, что крупные иммунные комплексы отмечались в 53% больных и их уровень был 0,147±0,01 ед. ОП, в то время как у остальных 37% больных в сыворотке крови выявлялись только мелкие и

средние комплексы. Таким образом, известный способ уступает предлагаемому в выявлении крупных ЦИК, играющих ведущую роль в патогенетическом процессе. В исследуемых осадках определяли

структуры с гидродинамическим радиусом с размерами от 5550 до 617 нм, ошибка измерения 1,5% в различных соотношениях, в среднем 1600±200 нм.

Формула изобретения Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови путем обработки полиэтиленгликолем 6000, отделения супернатан- та с последующей регистрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и обеспечения возможности одновременно регистрировать распределение циркулирующих иммунных комплексов по размерам, для обработки используют полиэтиленгликоль в конечной концентрации 0,1-0.5% в эквивалентном по объему соотношении, обработку проводят

24 ч, а затем отделяют супернатант, регистрацию проводят путем измерения спектра смещения света, рассеянного пробой до и после обработки, с одновременной регистПримечание. Ошибка метода ±0,25 г/л.

рацией оптической плотности раствора, при этом в качестве пробы сравнения используют сыворотку крови, обработанную физиологическим раствором.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5