Изобретение относится к биотехнологии , а именно к фрагментам нуклеиновых кислот (НК), и может быть использовано в эпидемиологии, вирусологии для выявления и идентификации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), вируса Западного Нила (ВЗН), вируса энцефалита долины Мюррей (ЭЦМ) и вируса энцефалита Сен-Луи (ЭСЛ).
Созданы простые и безопасные в получении, воспроизводимые по результатам тестирования зонды для выявления и идентификации ВКЭ, ВЗН, ЭЦМ и ЭСЛ, которые значительно облегчают задачу по получению коммерчески;, тес г-наборов для выявления и идентификации флавивирусев.
фрагмент НК представляет собой дезоксиолигонуклеотид длиной 18 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонуклео- тидов. Фрагмент НК имеет следующую . нуклеотидную последовательность:
5- dGCAGCTCCTACAACACCA-З .
Этот фрагмент для выявления и идентификации Э1М сконструирован на основе анализа известных нуклеотидных последовательностей геномов для ря- да эталонных флавивирусов. При этом в районе гена белка nS, выявлен консервативный для всех расшифрованных
GO
3
флавивирусов участок, состоящий из 18 нуклеотидов, который у любых дву флавивируг.ув отличается не менее, чем двумя точечными нуклеотидными заменами, и имеет следующую нуклео- тидную последовательность у разных вирусов:
ВКЭ (5r-3 ) UGGUGCUGCCGAACGUGC; ВЗН UGGUGCUGCAGAAGUUGC; :ЭДМ UGGUGUUGUAGGAGQUGC; |ЭСЛ UGGUGUUGCAGgAGCUGUj где подчеркнуты позиции, отличающиеся от последовательности вируса клещевого энцефалита. Наличие точечных замен на выявленном участке обеспечивает высокую специфичность полученого зонда, комплементарного выявленой последовательности.
Все эти фрагменты родственны по нуклеотидному составу и отличаются один от другого несколькими точечными заменами, позволяющими достаточно точно идентифицировать вирус при гибридизации.
Синтезированные фосфитамидным методом предлагаемые фрагменты нуклеиновых кислот испытаны с целью определения возможности их использовани в качестве зондов для выявления и идентификации как отдельных флавивирусов, так и флавивирусов, переносимых комарами. Для испытаний используют штаммы вирусов, полученные из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Л.И.Ивано ского и, следовательно, отличные от эталонных, полученных за рубежом Все испытанные фрагменты позволяют выявлять и идентифицировать соответствующие вирусы. .
Пример 1. Синтез дезокси- олигонуклеотидоэ - фрагментов НКа
НК синтезируют в количестве 1-10 45 оптических единиц на автоматическом синтезаторе фосфитамидным методом используя в качестве мономеров 5-0- -диметокситритил-М-ацил-З -(Р-метил- диизопропиламид)фосфаты нуклеозидов, 0 Чистоту полученных НК проверяют электрофорезом в 20%-ном денатурирующем полнакриламидном геле. Все синтезиро- эйиные фрагменты НК были не менее
Иммобилизация РНК на нитроцеялю- лозных фильтрах. РНК денатурируют прогревом а 7,51-ном растворе формальдегида 15 мин при 5&йС, добавляют раствор 20 «SSC ( М натрий хлорид - 0,3 М натрий цитрагj рН 7,0) до концентрации и образцы РНК наносят на нитроцеллюлозные фильтры, фильтры сушат при комнатной температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч, при 80°С.
Мечение олигонуклеотидов. Ояиго- нуклеотиды метят с помощью поли- нуклеотидкиназы Т в присутствии - 32Р-АТФ (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммопь олигонуклеотида.
Гибридизация. Нитроцеллюпозные фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридизаци- онной смеси состава: , 2,5 раствор Денхарта, (масса/объем)
80%-ной чистоты. Структуру синтезиро- ss додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл деванных фрагментов подтверждают анализом по Максаму-Тилберту.
Пример 2, Испытание полученных фрагментов в качестве зондов
натуркрованной и фрагментированной ДНК быка при а течение ч. Затем добавляют -меченый олигонук- леотид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибри и0
5
0
5
0
5
0
5 0
для выявления и идентификации флавивирусов.
Вирусы. В работе используют вирусы, полученные из Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им, Д.И.Ивановского. В кат честве вирусного материала используют мозг зараженных мышей. Белых беспородных мышей массой 6 - 8 г заражают в мозг 0, 03 мл а и рус соде ржа щей суспензии,содержащей около 6, 0 1р ЛД,. Животных забивают при появлении кли нических симптомов заболевания на k-7 сут от момента заражения. Мозг препарируют и хранят при . В качестве для анализа берут суммарную РНК мозга.;
Выделение суммарной РНК мозга. Суммарную РНК выделяют экстракцией горячим кислым фенолом (, рН 5,2) в присутствии додецилсульфзта натрия (5,0-1,0 мае./объем) с последующим спиртовым осаждением. Осадок РНК собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин. Осадок растворяют в 7,5%-ном формальдегиде - 10 мМ фосфата натрияррН , и определяю концентрацию РНК спектрофотометри- чески, принимая 1 о.е. мкг РНК:
Иммобилизация РНК на нитроцеялю- лозных фильтрах. РНК денатурируют прогревом а 7,51-ном растворе формальдегида 15 мин при 5&йС, добавляют раствор 20 «SSC ( М натрий хлорид - 0,3 М натрий цитрагj рН 7,0) до концентрации и образцы РНК наносят на нитроцеллюлозные фильтры, фильтры сушат при комнатной температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч, при 80°С.
Мечение олигонуклеотидов. Ояиго- нуклеотиды метят с помощью поли- нуклеотидкиназы Т в присутствии - 32Р-АТФ (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммопь олигонуклеотида.
Гибридизация. Нитроцеллюпозные фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридизаци- онной смеси состава: , 2,5 раствор Денхарта, (масса/объем)
додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл денатуркрованной и фрагментированной ДНК быка при а течение ч. Затем добавляют -меченый олигонук- леотид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибри изуют 6-16 ч при . Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоэвтогоасЬией на рентгеновскую пленку.с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике
Положительными принимались сигналы, превышающие уровень фона отрицательного контроля в 2-3 раза.
В табл„1 приведены флавивирусы, использованные в экспериментах по гибои/зизации. Результаты представ- , лек-i в табл,2. Как видно из результатов, зонд, комплементарный геномной W ВКЭ, реагирует в наибольшей степени с вирусом клещевого энцефа- гмгэ штамп Софьин. Реакция гэнда с друп ми вирусами незначительна и не превышает 5,9% (вирус Негиши) oi усозня реакции с гомологичным ви- оусом. Аналогичная высокая специфич кость была получена дпя других зондов; ЗН-33, который реагировал преимущественно с 83Н, ЗЦМ-ЗЧ который рс агирсвал преимущественно с вирусом 4ОЛ1.-Н:.1 Мюррей, СЛЕ-35, который реа- гиоовал преимущественно с вирусом
О v. ,
- /Г Ъльзование предлагаемого фрагмента нуклеиновых кислот для выяв- .),(-г. ,, идентификации ВКЭ обеспечи- сподующие преимущества: имею- :.ССР з настоящее время автоматически синтезаторы олигонуклеотидов поз Ј:,.|ЯЮ7 фосто и быстро получать лю- 6ые- фрагменты НК длиной до 30-70 нуклеотмдов, при получении зонда мс ключиется работа с вирусами, обеспечивается возможность получения зон дов практически в любых необходимых . количествах, в отличие от моно клона л иых антител возможен контроль зонда путем пооверки его химической струк™ туры, з отличие от моноклональных знтигел оозможно прогнозирование специфичности зонда, появляется возможность решения задачи по получению коммерческих тест-наборов для выявлений / идентификации большого числа фле.г- вирусов.
Выссчсую воспроизводимость предлагаемого метода иллюстрируют данные тэбл.З, где представлены результат -1 по.тосных экспериментов с чре- |18ратйк.и зонда. Оба препарата высоко специгн , о реагируют с ВКЭ с близ- , : j,ji :ам гибридизации (3758 и
-6
.ЪЗЗ ИМП/ .-. I. .С тах соответстьч,нно; . роаьнь гиориди зации с другими вирусами варьировал незначительно и не превышал 5F9 и 6,6% (вирус НегиоиО в первом и втором опытах относительно эталонного штамма ВКЗ.
Фор мула изобретения
Фрагмент нуклеиновых кислот - зонд для выявления и идентификации флавивирусов размером 18 нуклеотидов,
кодирующих консервативный участок белка nS.$ фпавивирусов, синтезированный химически с использованием в качестве мономеров модифицированных защищенных дезоксинуклеозидов,
со следующими нуклеотидными последовательностями:
5l dGCACGTTCGGCAGCACCA-3 для вируса клещевого энцефалита 5 dGCAACTTCTGCAGCACCA-З для вируса
Западного Нила|
5(-dGCAGCTCCTACAACA€;CA-3 для виоуса
энцефалита долины Мюррей;
5 f -dACAGCTCCTG6 AACACCA-3 для вируса
энцефалита Сен-Луи.
30
Т а & л и u a
Вирус
Обозначение
г
35
Комплекс клещевого энцефалита
Виоус кле щавого энцефалита, штамм
СофьинВКЗ
Омская геморрагическая лихорадкаОГЛ
Киасанурская лесная
болезчьКЛБ
НегишиHer
ЛангатЛан
ПовассанПов
Шотландский энцефаломиелит овец ШЭО
о
Подгруппа японского энцефалита
Вирус Западного Нила
Энцефалит долины Мюррей
ВЗН
э.ом
Подгруппа Денге
Ден
1,1
35 vпроцентах относительно ВКЭ.
Контроль - РНК нормального мозга мыши.
