НАБОР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЛАВИВИРУСОВ Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/68 C12N15/31 

Изобретение относится к созданию новых синтетических олигонуклеотидных зондов для идентификации флавивирусов.

Известны способы внутривидового типирования штаммов флавивирусов с помощью олигонуклеотидных зондов, описанные для вирусов Денге-2 и клещевого энцефалита (КЭ). В первом случае олигонуклеотидные зонды не были исследованы c какими-либо другими флавивирусами на наличие межвидовых перекрестов, при этом следует отметить неэффективность способа получения олигонуклеотидных зондов, не позволяющего даже приблизительно предсказать свойства получаемых зондов. Для зондов, использованных для внутривидового типирования штаммов вируса КЭ, отмечалась либо слишком узкая специфичность, либо наличие межвидовых перекрестов.

Существует также набор олигонуклеотидов, используемых в качестве видоспецифических зондов к четырем видам флавивирусов вирусам КЭ, Западного Нила, энцефалита долины Муррея, энцефалита Сан-Луи.

Однако к недостаткам этих зондов следует отнести наличие межвидовых перекрестов для зондов к вирусам КЭ (с вирусами Негиши, Киасанурской лесной болезни, шотландского энцефаломиелита овец) и энцефалита долины Муррея (слабая, но выше уровня фона гибридизация с вирусом энцефалита Сан-Луи), слишком узкую специфичность отсутствие гибридизации с некоторыми штаммами соответствующих видов для зондов к вирусам КЭ, Западного Нила. Кроме того, в данном наборе отсутствуют зонды к некоторым важным представителям флавивирусов: вирусам желтой лихорадки, японского энцефалита, вирусам комплекса Денге, что связано с созданием олигонуклеотидных зондов на основании недостаточного количества данных по структурам геномов флавивирусов.

Цель изобретения повышение точности видовой идентификации флавивирусов за счет использования высокоспецифических зондов.

Для достижения поставленной цели на основе компьютерного анализа всех опубликованных данных по структурам геномов флавивирусов отбирают наиболее перспективные участки геномов, получают к ним синтетические дезоксиолигонуклеотиды, исследуют их в молекулярной гибридизации с большим набором штаммов 16 видов флавивирусов и отбирают олигонуклеотиды, которые и предлагаются в качестве видо- и группоспецифических зондов для идентификации флавивирусов методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Зонды Л26, Ф1, Ф2, Ф3, Ф4, Ф5, Ф8, Ф9 и Ф10 (табл.1) избирательно гибридизовались только со штаммами тех вирусов, к структурам геномов которых были получены, т.е. соответственно клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, Денге-1, Денге-2, Денге-4, Западного Нила, энцефалита долины Муррея, энцефалита Сан-Луи, и не давали перекрестной гибридизации со штаммами других видов флавивирусов. Зонды Ф6 и Ф7, предлагаемые нами в качестве группоспецифичных, гибридизуются соответственно с вирусами комплексов японского энцефалита и Денге (табл.2).

Пример использования заявленных олигонуклеотидов для идентификации флавивирусов.

Синтез дезоксиолигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды синтезируют в количестве 1-10 оптических единиц на автоматическом синтезаторе фосфитамидным методом, используя в качестве мономеров 5-0-диметокситритил-N-ацил-3 2/Р-метилдиизопропиламид/-фосфаты нуклеозидов. Чистоту полученных олигонуклеотидов проверяют электрофорезом в 20% денатурирующем полиакриламидном геле. Все синтезированные олигонуклеотиды были не менее 90% чистоты. Структуру синтезированных олигонуклеотидов подтверждают по Максаму-Гилберту.

Исследование специфичности полученных олигонуклеотидов.

Вирусы. В работе используют вирусы, полученные из Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского (г. Москва). В качестве вирусного материала используют мозг зараженных мышей. Белых беспородных мышей массой 6-8 грамм или сосунков заражают в мозг 0,03 мл или 0,01 мл соответственно вируссодержащей суспензии, содержащей около 6,0 lg ЛД₅₀. Животных забивают при появлении клинических симптомов заболевания на 4-7 cутки от момента заражения. Мозг препарируют и хранят при -40^оС. В качестве образцов для анализа берут суммарную РНК мозга.

Выделение суммарной РНК мозга. Суммарную РНК выделяют экстракцией горячим фенолом (60^оС, рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия (1% мас. /об. ) с последующим спиртовым осаждением. Осадок РНК собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин. Осадок растворяют в 7,5% формальдегиде 10 мМ фосфате натрия, рН 7,0 и определяют концентрацию РНК спектрофотометрически, принимая 1 о.е. А₂₆₀ 40 мкг РНК.

Иммобилизация РНК на нитроцеллюлозных фильтрах.

РНК денатурируют прогревом в 7,5%-ном растворе формальдегида 15 мин при 56^оС, затем добавляют равный объем раствора 20 Х С (3,0 М хлорид натрия, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0) и наносят образцы РНК на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры сушат при комнатной температуре 15 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч при 80^оС.

Мечение олигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т4 в присутствии γ ^-32Р-AТФ (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммоль олигонуклеотида.

Гибридизация.

Нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридизационной смеси состава: 6 Х SSC, 2,5 Х раствор Денхардта, 0,5% (мас/об.) додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл денатурированной и фрагментированной ДНК быка при 65^оС в течение 1 ч. Затем добавляют ³²Р-меченый олигонуклеотид (0,2-0,5 пикомоль/мл) и гибридизуют 18-22 ч при 42^оС для зонда Ф 6, 45^оС для зонда Ф 7, 50^оС для зонда Ф 5, Ф 8, Ф 10, Л 26, 55^оС для зондов Ф 1, Ф 2, Ф 3, Ф 4, Ф 9. Радиоактивность, связавшуюся с фильтром, выявляют радиоавтографией на рентгеновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Положительными принимают сигналы, превышающие уровень фона в 2-3 раза.

Заявляемый набор олигонуклеотидных зондов апробирован при исследовании 50 штаммов 16 видов флавивирусов.

Положительный эффект усовершенствование лабораторной диагностики флавивирусов.

Использование: вирусология, создание новых синтетических олигонуклеотидных зондов для идентификации флавивирусов. Предлагаемый набор олигонуклеотидных зондов предусматривает проведение четкой видовой идентификации 9 видов флавивирусов. В набор входят также группоспецифичные зонды - к вирусам японского энцефалита и Денге I, II, IV клещевого энцефалита желтой лихорадки, а также для идентификации вируса энцефалита долины Муррея и энцефалита Сан-Луи. 6 табл.

НАБОР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЛАВИВИРУСОВ, содержащий олигонуклеотидные зонды, отличающийся тем, что он содержит олигонуклеотидные зонды ТТТЦЦТТТЦАГААТГГЦЦТТ для идентификации вируса клещевого энцефалита, ААЦЦТЦТАГАЦЦЦЦГТЦТТТ для идентификации вируса желтой лихорадки, ЦТАГТАГЦГАТГТТГАГАТ для идентификации вируса японского энцефалита, ЦТАЦТААГТТТГТЦАГЦТЦА для идентификации вируса Западного Нила, ТЦААГГГТГГГТТТГТЦАГЦ для идентификации вируса энцефалита Долины Муррея, ГГАТТЦЦЦТГЦТААААААЦТ для идентификации вируса энцефалита Сан-Луи, АТЦЦЦТГЦТГТТГГАГГТАТ для идентификации вируса Денге-1, АТАГТЦЦАТГАГАЦЦЦЦАЦТ для идентификации вируса Денге-2, ТТТТЦЦАГАГАТЦТГЦТЦТЦ для идентификации вируса Денге-4, ЦЦТЦЦТГГТТТТТТАГАЦАТ для идентификации вирусов группы японского энцефалита, ТЦАГАГАТЦТГЦТЦТЦТА для идентификации вирусов группы Денге.