Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фрагментам нукле- иновых кислот (НК) , и может быть пользовано в эпидемиологии, вирусологии для выявления и идентификации срлавиэирусов, переносимых комарами (ФПК) из подгрупп японского энцефалита , лихорадки денге и желтой лихорадки.
Создан простой и безопасный в по- лучен(- ч, воспроизводимый по результатам тестирования, зонд для выявления и идентификации ФПК из подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки, который значительно облегчает задачу по получению коммерческих тест-набо- POU для ;л,-явления и идентификации флавивирусов.
Зонд представляет собой дезокси- олигонуклеотид длиной 20 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонукле- отидов. Фрагмент НК имеет следующую нуклеотидную последовательность:
S -dCGGTCTCCTCTAACCTCTAG-S .
Фрагмент для выявления и идентификации ФПК сконструирован на основе анализа известных нуклеотидных последовательностей геномов для ряда эталонных флавивирусов. При этом в районе 130 нуклеотидов от 3- - конца генома обнаружена последовательность из 20 нуклеотидов, идентичная для всех расшифрованных ФПК (вируса японского
СО
энцефалита, вируса Западного Нила, энцефалита долины Мюрреи, вируса желтой лихорадки, вируса лихорадки Денге 2 следующего состава:
() CUAGAGGUUAGAGGAGACCC.
Синтезированный фосфитамидным методом предлагаемый фрагмент НК, ком-при 6000 об/мин. Осадок растворяют в буфере 7,5% формальдегид - 10 мМ наг рий фосфат, рН 7,0, и определяют концентрацию РНК спектрофотометричес ки, принимая 1 о.е. A2W 40 мкг РНК
Иммобилизация РНК на нитроцеллю- лозных фильтрах. РНК денатурируют прогревом в 7,5%-ном растворе форплементарный выявленной последовательно мальдегида 15 мин при 5бвС, затем
ности, испытан с целью его применения в качестве зонда для выявления и идентификации ФПК. Для испытаний исполь« зуют штаммы вирусов, полученные из
добавляют раствор 20ySSC (3,0 M натрий хлорид - 0,3 М натрий цитрат, РН 7,0) г.о концентрации и образцы РНК наносят на нчтроцеллюлозГосударственной коллекции вирусов Ин- ные фильтры, фильтры сушат при ком20
30
ститута вирусологии им. Д.И.Иванско- го и, следовательно, отличные от эталонных, полученных за рубежом.
Пример 1. Синтез дезокси- олигонуклеотида - фрагмента НК,
Фрагмент НК синтезируют в количестве 1-10 оптических единиц (о.е.) на автоматическом синтезатора фосфитамидным методом, используя в качестве мономеров 5 -0-диметокситритил 25 -М-ацил 3 -(Р-метилдиизопропиламид) фосфаты нуклеозидов. Чистоту полученных НК проверяют электрофорезом в 20%-ном денатурирующем полиакрил- амидном геле. Синтезированный дезок- сиолигонуклеотид был не менее 80%-ной чистоты. Структуру фрагмента подтверждают анализом по Максаму-Гилберту,
Пример 2. Испытание полученного фрагмента НК в качестве зонда для выявления и идентификации комариных флавивирусов.
Вирусы. В работе используют вирусы, полученные из государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского. В качестве вирусного материала используют мозг зараженных мышей. Белых беспородных мышей массой 6-8 г заражают в мозг 0,03 мл суспензии вируса, со- держащей около 6,0 lg JlfljQ вируса. Животных забивают при появлении клинических симптомов заболевания на 4-7 сут от момента заражения. Мозг препарируют и хранят при -40РС. В качестве образцов для анализа берут суммарную РНК мозга.
Выделение суммарной РНК мозга. Суммарную РНК выделяют экстракцией горячим кислым фенолом (60дС, рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия (0,5-1,0 мас.% объем) с последующим спиртовым осаждением. Осадок РНК собирают центрифугированием 30 мин
35
40
45
50
55
натнсй температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч при .
Мечение олигонуклеотидов. Олиго- нуклеотиды метят с помощью полинукле отидкиназы (13) в присутствии 32-р-дтр (ЮОО Ки/ммоль) до удельной активности 500-ТООО Ки/ммоль олигонуклеотида.
Гибридизация. Нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридиза-0 ционной смеси состава: 6 VSSC, 2,ЗУ раствор Денхарта, 0,5% (масса/объем) додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл денатурированной и фрагментироаанной ДНК быка при в течение 1 ч. Затем добавляюг гР-меченый олигонукле отид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибриди- зуют 6-18 ч при . Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоавтографией на рентгеновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жид костном сцинтилляционном счетчике.
Положительными принимались сигналы, превышающие уровень фона отрицательного контроля в 2-3 раза.
Для подтверждения высокой специфичности полученного зонда испытания проведены на ряде флавивирусов, перечень которых и условные обозначения приведены в табл.1.
Результаты дифференциальной детекции флавивирусов с помощью синтетического зонда-фрагмента НК приведены в табл.2.
Как видно из табл.2, зонд, компл ментарный геномной РНК комариных фла вивирусов, реагирует в наибольшей степени с флавивирусами подгрупп японского энцефалита и Денге. Реакция зонда с флавивирусами комплекпри 6000 об/мин. Осадок растворяют в буфере 7,5% формальдегид - 10 мМ наг- рий фосфат, рН 7,0, и определяют концентрацию РНК спектрофотометричес- ки, принимая 1 о.е. A2W 40 мкг РНК.
Иммобилизация РНК на нитроцеллю- лозных фильтрах. РНК денатурируют прогревом в 7,5%-ном растворе формальдегида 15 мин при 5бвС, затем
мальдегида 15 мин при 5бвС, затем
добавляют раствор 20ySSC (3,0 M натрий хлорид - 0,3 М натрий цитрат, РН 7,0) г.о концентрации и образцы РНК наносят на нчтроцеллюлозные фильтры, фильтры сушат при ком0
0
5
5
0
5
0
5
натнсй температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч при .
Мечение олигонуклеотидов. Олиго- нуклеотиды метят с помощью полинукле- отидкиназы (13) в присутствии 32-р-дтр (ЮОО Ки/ммоль) до удельной активности 500-ТООО Ки/ммоль олигонуклеотида.
Гибридизация. Нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридиза-0 ционной смеси состава: 6 VSSC, 2,ЗУ раствор Денхарта, 0,5% (масса/объем) додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл денатурированной и фрагментироаанной ДНК быка при в течение 1 ч. Затем добавляюг гР-меченый олигонукле- отид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибриди- зуют 6-18 ч при . Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоавтографией на рентгеновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жид1- костном сцинтилляционном счетчике.
Положительными принимались сигналы, превышающие уровень фона отрицательного контроля в 2-3 раза.
Для подтверждения высокой специфичности полученного зонда испытания проведены на ряде флавивирусов, перечень которых и условные обозначения приведены в табл.1.
Результаты дифференциальной детекции флавивирусов с помощью синтетического зонда-фрагмента НК приведены в табл.2.
Как видно из табл.2, зонд, комплементарный геномной РНК комариных фла- вивирусов, реагирует в наибольшей степени с флавивирусами подгрупп японского энцефалита и Денге. Реакция зонда с флавивирусами комплекса клещевого энцефалита, которые переносятся клещами, незначительна и не превышает 8,3% (вирус Повассан) от уровня реакции с ВЯЭ.
Высокую производительность предлагаемого метода иллюстрируют данные повторных экспериментов с двумя препаратами зонда. Оба препарата высокоспецифично реагируют с комариными флавивирусами с близким уровнем гибридизации (301 и 2767 имп/ми для ВЯЭ в опытах 1 и 2 соответственно), Уровень гибридизации с вирусами комплекса клещевого энцефалита варьирует незначительно и не превышает 8,3 и 8,8% (вирус Повассан) в опытах относительно этапон- ного вируса японского энцефалита.
При этом использование предлагаемого фрагмента НК для выявления и идентификации ФПК обеспечивает следующие преимуществаf имеющиеся в настоящее время автоматические синтезаторы олигонуклеотидов позволяют просто и быстро получать любые фрагменты НК длиной до 30-70 нуклеотидов; при получении зонда исключается работа с вирусами/ обеспечивается возможность получения зондов практически Б любых необходимых количествах Б отличие от моноклопальных антител возможен контроль зонда путем проверки его химической структуры; в отличие от моноклональных антител возможно прогнозирование специфичности зонда| появляется возможность решения задачи по получению коммерческих тест-наборов для выявления и идентификации большого числа флавивирусов.
Формула изобретения
Фрагмент нуклеиновой кислоты - зонд для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами размером 20 нуклеотидов, синтезиро
ванный химичс « - использованием в качестве мономеров модифицированных защищенных дезоксинуклеозидов и характеризующийся следующей нуклео- тидной последовательностью:
5 -dGGGTCTCCTCTAACCTCTAG-З.
Таблица 1
Обозначение
Вирус
Комплекс клещевого энцефалита
Вирус клещевого энцефалита, штамм СофьинВКЭ
Омская геморрагическая лихорадка ОГЛ
Киасанурская лесная
болезньКЛБ
НегишиHer
Лангат Лан
ПовассанПов
Шотландский энцефаломиелит овец ШЭО
Подгруппа японского энцефалита
Вирус Западного
Нила
Энцефалит долины Мюррей
Энцефалит Сен-Луи
Вирус японского энцефалита
ВЗН
ЭДМ ЭСЛ
ВЯЭ
45
Подгруппа Денге Вирус Ленге 2Ден
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом ПЦР в режиме реального времени | 2022 |
|
RU2808520C1 |
| Фрагмент нуклеиновой кислоты - зонд для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами | 1989 |
|
SU1678835A1 |
| НАБОР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЛАВИВИРУСОВ | 1990 |
|
RU2057811C1 |
| ХИМЕРНЫЕ ФЛАВИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ | 1998 |
|
RU2209082C2 |
| Рекомбинантные белки, содержащие антигенные эпитопы белков Core, Small Envelope, NS2A и preM вируса Зика, и комплексный антиген, содержащий указанные белки и используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и M к вирусу Зика | 2017 |
|
RU2661085C1 |
| ФЛАВИВИРУС С ДВУХКОМПОНЕНТНЫМ ГЕНОМОМ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 2008 |
|
RU2527891C2 |
| к-ДНК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (TBEV) | 1995 |
|
RU2202612C2 |
| Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом клещевого энцефалита на основе рекомбинантного вируса рода Flavivirus | 2022 |
|
RU2795800C1 |
| Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации РНК вируса лихорадки Рифт-Валли методом изотермической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | 2023 |
|
RU2813519C1 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФЛАВИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ | 2006 |
|
RU2465326C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к конструированию фрагментов нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в вирусологии и эпидемиологии, для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами из подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки. Для этого синтезировали химически с использованием в качестве мономеров защищенных дезок- синуклеозидов олигокуклеотид, состоящий из 20 оснований, следующей последовательности: 5-dGGGTCTCCTCTAACCTCTAC-3 Эта последовательность идентична для всех расшифрованных флавивирусов, переносимых комарами. Использование синтезированного зонда позволяет быстро и просто тестировать исследуемый материал на наличие флавивирусов. 2 табл.
Комплексклещевого энцефалита
ВКЭ89 (2,9)89
ОГЛ91 (3)86
КЛБ88 (2,9)85
Her92 (3)83
Лан91 (2,9)80
Таблица
2
Гибридизация приведена в количестве радиоактивности (имп/мин) и в % относительно ВЯЭ. РНК нормального мозга мыши. °
