Способ определения активности фосфолипазы С Советский патент 1991 года по МПК G01N24/08 

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии.

Цель изобретения - сокращение времени определения активности фосфолипазы С.

Способ заключается в том, что измерение активности фосфолипазы С проводитсл по изменению интегральной интенсивности сигнала фосфатидилхолина (ФХ) с поеденным ферментом в процессе расцепления ФХ до диацилглицирина и Фосфохолина, определяемое при регистрации 31 р ямс спектров в течение часа после начала реакции. Расчет проводят по формуле

.. ФХ AS 1000 -10 м / / Е - ---F- о огг мкМоль/мин/мг,

Ь Т Ь j2 ЛЬ

где ФХ - количество лецитина (фосфатидил- холина), дающее сигнал на спектре;

S - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, в нормированных условных единицах;

AS- изменение интегральной интенсивности сигнала за единицу времени, о нормированных условных единицах;

t - время, за которое определяют изменение интегральной интенсивности сигнала, мин;

Б - количество добавленного в образец фермента, мг;

1/25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг на неорганический фосфатДРн) для ФХ с мол.мае. около 800;

1/32 - коэффициент пересчета количества Рн, мМоль, в ФХ, а при хЮОО, мкМоль;

10 - поправочный коэффициент, полученный на основе калибровки.

Способ позволяет измерять активность фермента в процессе непрерывного протекания реакции.

Способ осуществляют следующим образом.

Озвученную суспензию лецитина (не менее 100 мг) в 50 мМ Трис-HCI буфере (рН 7,4) помещают в ампулу для ЯМР-спектро- скопии и регистрируют спектр 31р-ямр в течение времени, необходимого для накопления достаточного по интенсивности сигнала. При этом необходимо проводить измерение в режиме с как можно меньшим временем накопления сигнала (от 30 с до 3-5 мин).

На фиг. 1 приведен типичный спектр 31р-ямр озвученной суспензии ФХ в 50 мМ Трис-HCI буфере (рН 7,4). На спектре обнаруживается один сигнал с химическим сдвигом 0,2 м.д., соответствующий фосфатной группе фосфатидилхолина. Добавление в суспензию лецитина (ФХ) ионов кальция (в конечной концентрации 10-20 мМ) - активатора фосфолипазы С не меняет форму и интегральную интенсивность сигнала.

Далее в ампулу добавляется фермент - фосфолипаза С (не менее 1 мг). Образец быстро перемешивается и помещается в ЯМР-спектрометр для регистрации серии 31р-ямр спектров в течение 15-60 мин. В каждом из полученных 31р-ямр спектров определяется интегральная интенсивность

сигнала фосфатидилхолина. Так как в процессе реакции от лецитина отщепляется фосфохолин, сигнал от фосфорной группы которого « (-) 4 м.д., то на

н

0

и

H-C-0-C-R°

I о

«KWnunoja H-C-0-C-R 0 0 cHj rN

М-С-О-Р-О-(СНЛ-М-(СИ,Ьн« -

н о V

н с о C-R

I ,Р

Н-С 0-С-р.

(CM,)j

/JCUUfnuH

1.2-inauuii- шиерич

31р-ямр спектрах в процессе реакции сигнал от фосфатидилхолина (лецитина) уменьшается, а в области (-4 м.д.) появляется и

возрастает со временем сигнал от фосфохо- лина (фиг. 2).

Интегральная интенсивность сигнала в спектрах 31р-ямр пропорциональна количеству ядер фосфора и соответствует определенному количеству лецитина в образце.

Кинетика уменьшения интегральной интенсивности сигнала ФХ, измеренная в процессе фосфолипазной реакции, отражает активность фермента фосфолипазы С. Чем больше скорость падения сигнала, тем активнее препарат фермента.

Зная интегральную интенсивность сиг- нала,строят график зависимости ее от времени ферментативной реакции (фиг. 3) и определяют активность фермента по указанной формуле.

Способ апробирован с использованием препарата фосфолипазы С из бактерий Candida Welchll фирмы Sigma с активностью 5 ед/мг. 1 ед. высвобождает 1 мкМольводорастворимого органического фосфора из Z - а -фосфатидилхолина в минуту при рН 7,3 и 37°С. Пример. Озвученную суспензию лецитина готовят следующим образом. 100 мг лецитина (Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов) из раствора в спирте переносят в специальную ампулу для озвучивания. Спирт удаляют под вакуумом, а к лецитиновой пленке добавляют 2 мл 50 мМ Трис-HCI буфера, рН 7,4. Озвучивание

проводят на дезинтеграторе УЗДН-1 (Харьковского завода) в течение 3 мин с паузами для охлаждения в режиме максимального резонанса при 0,3 мА. Далее образец центрируют при 2500 об/мин в течение 3 мин.

Супернатант используют для работы. 2 мл озвученного лецитина помещают в ампулу для ЯМР-спектроскопии.Добавляют 0,5 мл ДгО и 50 мкл 1 М CaCl2. Регистрируют 31р-ямр спектр субстрата (фиг. 1). Спектры 31р-ямр

высокого разрешения образцов лецитина регистрируют на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 81 МГц при 37°С без вращения ампулы и без подавления спин-спинового взаимодействия ядер 31 р с протонами. Спектры

получают с использованием 45°-х импульсов и временем выборки 0,82 с с задержкой 1 с. Снижения уровня шумов достигают умножением функции спада сигнала свободной индукции на экспоненциальную функцию. Значение химических сдвигов сигналов в спектрах в миллионных долях (м.д.) приведены относительно сигнала 85% НзРО/1.

В ампулу с лецитином добавляют 1 мг фермента - фосфолипазы С, быстро переме- шивают и каждые 2,5 мин регистрируют спектры 31 Р-ЯМР в течение 60 мин в процессе расщепления фосфатидилхолина до диа- цилглицерина и фосфохолина. В исходном спектре и первом спектре после добавле- ния фосфолипазы С интегральная интенсив- ность сигналов фосфатидилхолина одинаковая - 80,2 нормированных условных единиц. Строят график зависимости между интегральной интенсивностью сиг- нала фосфатидилхолина и временем реакции (фиг. 3). Далее по графику определяют изменение интегральной интенсивности сигнала фосфатидилхолина с введенным ферментом за единицу времени, например за 10 мин (фиг. 3) - 3,5 нормированных условных единицы. Исходная интегральная интенсивность сигнала ФХ равна 80,2 нормированных условных единицы и обусловлена она 80 мг лецитина. В 2,5 мл образца ( 2 мл озвученного фосфатидилхолина + 0,5 мл Д2О) содержится 100 мг лецитина. Однако сканирование спектра происходит лишь с обьема 2 мл, вокруг которого имеется магнитная катушка ЯМР-спектрометра, 2 мл со- держимого ампулы составляет 80 мг лецитина. Подставляют данные в формулу и получают

Р - 80х3.5х 1000 х 10

80,2x10x1x25x32 4,4 мкМоль Рн/мин/мг.

Из фиг. 3 видно, что для измерения активности фермента фосфолипазы Q необхо- 45 димо и достаточно получение 5-10

5

10 15 20 5 0 5

0

5

экспериментальных точек в первые 15-20 мин проведения реакции. Способ позпотчот быстро и достоверно определять активность фосфолипазы С.

Формула изобретения Способопределения активности ФосФо- липазы С, предусматривающий расщепление озвученного фосфатидилхолина до диацилг- лицерина и фосфохолина с последующим расчетом ее по формуле, отличающий- с я тем, что, с целью сокращения времени определения, регистрируют 31р-ям1 спектр субстрата и серию спектров 31р-ямр с введенным ферментом в процессе расщепления фосфатидилхолина до диацилглицерина и фосфохолина, определяют интегральную интенсивность субстрата и изменение интегральной интенсивности с введенным ферментом за единицу времени, а активность фермента рассчитывают по формуле

.. ФХ AS 1000 -10 ., , / Е - г---F-оо оЈ- мкМоль/мин/мг, о t Б 32 25

где ФХ - количество лецитина (фосфатидил- холина), дающее сигнал на спектре. мкМоль;

S - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, в нормированных условных единицах;

AS- изменение интегральной интен- сив -.ости сигнала за единицу времени, в нормированных условных единицах;

t - время, за которое определяют изменение интегральной интенсивности сигнала, мин;

Б - количество определяемого в образце фермента, мг;

1/25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг, на неорганический фосфат (Рн) для ФХ с мол.мае. около 800;

1/32 - коэффициент пересчета количества РН, мМоль, в фосфатидилхолине. а при хЮОО - в мкМоль;

10 - поправочный коэффициент, полученный на основе калибровки.

0,2 м.д.

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии. Цель изобретения - сокращение времени определения активности фосфолипазы С. Способ заключается п измерении активности фосфолипазы С, которое проводится по изменению интег рлльноп интенсивности сигнала фосфатидилхолина (Ф) с введенным ферментом в процессе рас щепления Ф до диацилглицерина и фогфп холина, определяемое при регистрации 31р-ямР спектров в течение часа после нача ла реакции. Расчет проводят по формуле Е ФХ -AS- 1000- 10/S-f Б- 32 -25 (мкМоль/мин/мг), где ФХ количество яе цитина (Ф), дающее сигнал на спектре, мкМоль; S - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, в нормированных условных единицах; AS- изменение интегральной интенсивности сигнала за единицу времени, в нормированных условных единицах; t - время, за которое опреде- ляют изменение интегральной интенсивности сигнала, мин.Б - количество добавленного в образец фермента, мг, 1 /25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг, на неорганический фосфат (Рн) для ФХ с мол. мае. около 800, 1/32 -- коэффициент пересчета количества Рн, мМоль, в ФХ, а при 1000 - в мкМоль; 10 - поправочный коэффициент, полученный эмпирически. Способ позволяет измерять активность фермента в процессе непрерывной реакции. 3 ил, k/ с о со го со о VI

в

i. , i

L

i

-8 -6 -4 -2

Фиг.2 А - Ю мин от нача/ta реакции

Б - ttt$ мин от начала реакции 5-60 пин от начала реакции

1- фосфат isdiwro/71/на

2- сигнал фосфехолина

О 2 U Xumi/tcru

0,85

0,80 0,75

0,70 0,65

I

Ю

20

X

JL

JL

30 иг.З

Ю 50

60

J

70

t(MUH)