СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ Д Российский патент 1995 года по МПК G01N21/78 C12N9/20 G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в научной работе и при проведении серийных анализов в клинической биохимии, в диагностической медицине, в пищевой и микробиологической промышленности, при контроле биотехнологических процессов, при получении физиологически активных соединений и фосфолипидов и в других областях.

В современной практической биохимии существует необходимость контроля целого ряда процессов, протекающих с участием фермента фосфолипазы D (ЕС 3.1.4.4. ), расщепляющего отдельные фосфолипиды в животных, растительных и бактериальных клетках с образованием фосфатидной кислоты (ФК) и соответствующего спирта.

Необходимость качественного и количественного определения активности фосфолипазы D (ФЛ-D) в животных тканях, суспензиях бактериальных и животных клеток и в биологических жидкостях обусловлена участием этого фермента в реализации инозитольного цикла в клетке. Определение активностей ФЛ-D является важным показателем и для клинической медицины в связи с инозитольным циклом, ответственным за рецепцию некоторыми клетками и тканями определенных эффекторов. Для растительных клеток активация эндогенных ФЛ-D приводит к снижению качества сельхозпродукции, и контроль активности ФЛ-D позволяет определять сроки и условия ее хранения.

Кроме того, ФЛ-D используется для расщепления отдельных природных фосфолипидов и их смесей с последующим химическим синтезом других модифицированных фосфолипидов и некоторых физиологически активных веществ.

Общепринятые методы тестирования активности ФЛ-D основаны на измерении количества холина, высвобождающегося в результате ФЛ-D реакции. При этом холин определяется в виде рейнеката холина Cr(NH₃)₂(SCN)₄, в виде эннаиодита или по радиоактивности водной фазы с использованием ³Н-меченого ФХ.

К основным недостаткам известных методов следует отнести отсутствие специфичности определения активности ФЛ-D. В этих методах нет уверенности, что образовавшийся свободный холин не является результатом совместного действия нескольких других ферментов, например, фосфодиэстеразы, при действии на глицерофос- фохолин. Кроме того, описанные методы являются относительно низкочувствительными (100 мкг ФК дают около 0,1 ед.А). Повышение чувствительности общепринятых методов достигается использованием радиоактивно-меченого ФХ, что требует специального оборудования и существенно сужает область использования данного метода, например, для определений в тканях и жидкостях человека, т.е. для целей медицинской диагностики.

Общепринято, что более точные определения активности ФЛ-D следует проводить по ФК, которую по методу прототипа можно определять только после ТСХ.

В качестве прототипа выбран способ определения активности фосфолипазы D, которая измеряется по приросту ФК, образовавшейся из ФХ-везикул с участием в качестве акцептора воды. Реакционную смесь, содержащая необходимые добавки, включая эмульсию ФХ-везикул в качестве субстрата, растворы Са²⁺, этиловый эфир и определенное количество ФЛ-D, инкубируют 10 мин при 30^оС и затем к смеси добавляется 0,1 мл 1н. HCl и 2 мл этилового эфира, смесь центрифугируют, эфирный слой переносят в другую склянку, выпаривают на роторном испарителе и затем фосфолипидную пленку используют для проведения ТСХ. Пятно ФК переносят в другую пробирку и количественно определяют молибденовым реагентом по неорганическому фосфату после сжигания ФК в смеси хлорной и серной кислот. Активность фермента выражается в мкмоль ФК, образовавшейся за 10 мин. Удельную активность фермента пересчитывают на 1 мг белка реактора фермента. Время, необходимое на проведение одного измерения активности ФЛ-D, составляет около 7-8 ч и требует специального оборудования, включая роторный испаритель, оборудование для проведения ТСХ и сжигания фосфолипидов и т.д. Таким образом, к недостаткам прототипа следует отнести необходимость и времяемкость проведения экстракции фосфолипидных образцов после проведения ФЛ-D реакции (около 2-3 ч); необходимость проведения одно- или двухмерной ТСХ фосфолипидов, что требует необходимого оборудования (камеры, пластинки, растворители и т.д.) и занимает примерно 1 ч; трудоемкость и времяемкость количественного определения фосфолипидов со сжиганием пятен ТСХ, что занимает около 2 ч; относительно невысокую чувствительность методов, основанных на сжигании фосфолипидных пятен (25 мкг фосфолипидов дают 0,120 ед.А).

В основе предлагаемого способа тестирования активности ФЛ-D лежит разработанный ранее способ количественного определения холиннесодержащих фосфолипидов с красителе VBR.

Активность ФЛ-D определяется, исходя из следующей схемы ферментативного превращения
ФХ ФК + холин
Поскольку фосфатидилхолин (ФХ), взятый в качестве субстрата для ФЛ-D реакции, не красится VBR-методом, то теоретически представлялось возможным определение активности ФЛ-D этим способом. Однако предварительные эксперимента показали, что это не так. На практике оказалось, что инкубационная смесь для ФЛ-D реакции дает очень сильное контрольное окрашивание (более 1,5 ед. А), что не позволяет тестировать образование ФК. Причина этого заключается в том, что добавки в инкубационную среду от 5 до 50 мМ Са²⁺, добавление раствора фермента ФЛ-D и присутствие других солей критически сказываются на окрашивании контрольных проб ФК-суспензий, в которых ФЛ-D-реакция была остановлена охлаждением во льду, т.е. без применения останавливающих реакцию растворов, содержащих большие количества спиртов, способных давать высокое контрольное окрашивание. Так применение останавливающих растворов (100 мкл 1 н. HCl на образец или 300 мкл изопропанола на 150 мкл образца с последующим прогреванием образцов при 95^оС 3 мин). Вместе с тем использование останавливающих растворов является более предпочтительным, чем охлаждение и особенно важно для проведения кинетических измерений активности ФЛ-D, т.к. они обеспечивают необходимую быстроту остановки ФЛ-D реакции, хотя останавливающие растворы сами по себе дают контрольное VBR-окрашивание более 2,0 ед.А, что практически не позволяет проводить измерения ФЛ-D активности этим способом.

Таким образом, прямое использование разработанного ранее способа с VBR-красителем для определения активности ФЛ-D оказалось с учетом изложенного выше невозможным.

С целью устранения этих принципиальных трудностей, не позволяющих проводить определения активности ФЛ-D, был проведен экспериментальный поиск различных водных и неводных растворов и их смесей для удаления мешающих красящихся примесей из хлороформных экстрактов после проведения ФЛ-D реакции и последующего использования останавливающих растворов (спирты, HCl и т.д.).

Предварительно были испытаны различные способы отмывки хлороформного экстракта фосфолипидов после проведения ФЛ-D и остановки ее останавливающими растворами, перечисленными выше. Испытали различные солевые водные растворы (NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄, CaCl₂, CuSO₄, Na₃PO₄, FeCl₃, NH₄CNS, Na-цитрат, Na-уксуснокислый, Na-щавелевокислый, К,Na-виннокислый и др. в концентрации от 0,1% до насыщенной в воде концентрации). Были испытаны также различные кислые растворы (HCl, уксусная кислота, аскорбиновая кислота, лимонная кислота и др. в концентрации от 1% 10%), различные щелочные растворы (Na₂SO₃, NaHCO₃, К, Na-виннокислый, (NH₄)₂CO₃, NH₄HCO₃, NaOH и др. в концентрации от 1% до насыщенной в воде концентрации), различные сложные смеси (глицерин вода, этиленгликоль-вода, глицерин-этиленгликоль, глицерин-ацетон, глицерин-изопропанол, глицерин-метанол, этиленгликоль-ацетон, этиленгликоль-изопропанол, этиленгликоль-метанол, формамид-этиленгликоль, глицерин-метанол, глицерин-ДМСО, ДМСО-этиленгликоль и различные другие комбинации перечисленных выше органических растворителей в различных соотношениях бинарных смесей от 0 до 100%), водные растворы органических веществ (сахароза-вода, глюкоза-вода, формамид-вода, ДМСО-вода и др. в различных соотношениях от 0 до 100%) в различных соотношениях оказались мало или недостаточно эффективными для уменьшения оптической плотности контролей в VBR-способе.

В результате многочисленных испытаний различных водных и неводных растворов различных веществ и их смесей, указанных выше, было обнаружено, что использование водных насыщенных растворов мочевины для промывки липидных экстрактов и для приготовления растворов VBR-красителя позволяет весьма существенно снизить величины оптической плотности контролей с 2,5 ед.А до 0,2-0,3 ед. А, что является вполне приемлемым для проведения определения активности ФЛ-D. Повторная промывка контрольных образцов дает величину 0,020-0,060 ед. А, что является идеальным для спектрофотометрии. Кроме того, оказалось существенным использование VBR-реактива, приготовленного не на смеси этиленгликоль-глицерин (1: 1), как было разработано ранее, а приготовленного на растворе насыщенной мочевины из расчета 13,5 мг VBR-красителя на 100 мл насыщенного водного раствора мочевины. Насыщенный водный раствор мочевины обладал по сравнению с другими промывочными растворами, например с насыщенными водными растворами сахарозы, глюкозы и водными растворами формамида и диметилсульфоксида (ДМСО) в соотношениях от 0 до 100% следующим целым рядом принципиальных преимуществ:
существенно снижаются значения (А) контролей (с около 2,5 до 0,2-0,3 ед. А);
происходит быстрое исчезновение мутности образцов в процессе расслоения водной и неводной фаз;
не наблюдается какого-либо заметного выхода фосфолипидов в процессе отмывки и в процессе взаимодействия фосфолипидов с VBR-красителем, приготовленным на насыщенном водном растворе мочевины;
по степени удаления VBR-красящих примесей предлагаемый раствор оказался значительно лучше всех испытанных.

Предлагаемый способ определения активности ФЛ-D основан на измерении количества ФК, образующейся в результате расщепления ФХ-везикул, взятых в качестве субстрата, в присутствии необходимых добавок (Са, буфера, эфира и т. д. ). Реакцию запускают добавкой раствора фермента ФЛ-D с последующей с последующей инкубацией при 30^оС 10 мин, после чего к реакционной смеси добавляют останавливающий раствор или образцы погружают в ледяную баню с последующим определением количества образовавшейся ФК в виде окрашенного комплекса с VBR-реагентом, экспериментально разработанным для этих целей.

Существенное значение для выполнения данного способа имеет то обстоятельство, что ФХ, взятый в качестве субстрата этой реакции, не окрашивается разработанным VBR-реагентом, в то время как продукт этой реакции -ФК, образуя комплекс с красителем, дает интенсивное окрашивание, измеряемое спектрофотометрически при 590 нм.

Количество ФК определяется калибровочной кривой, построенный для стандартного раствора ФК с применением разработанного способа.

На чертеже представлены калибровочные кривые для ФК (фосфатидной кислоты), полученные по разработанному способу. Прямая пропорциональность в определении количества ФК наблюдается в интервале от 5 мкг до 140 мкг ФК, т.е. от 0,050 до 1,5 ед. А.

Таким образом, активность фермента ФЛ-D измеряется по приросту ФК и выражается в мкмоль ФК, образующейся за 1 мин. Удельная активность препарата фермента рассчитывается на 1 мг белка.

В случае образования небольшой мутности образцов, которая, как правило, не мешает определению, можно к окрашенному хлороформенному экстракту добавить перед измерением щепотку безводного сульфата натрия (около 100 мг/образец), который быстро убирает остаточную мутность и не мешает определению. Другим надежным способом устранения мутности образцов является предварительное кратковременное, низкоскоростное центрифугирование (1-2 мин прим 2-2,5 тыс. об. ) образцов для расслоения хлороформенной и этиленгликолевой фаз.

Образовавшаяся окраска стабильна очень длительное время (несколько месяцев), если только не происходит химическая или ферментативная деградация ФК. Стабильность приготовленного VBR-реагента составляет более года.

Суммарное время, необходимое для определения образовавшейся ФК в одном образце, составляет 10 мин, для 10 образцов около 15 мин. Коэффициент вариации при определении количества ФК для 10 одинаковых образцов составил 3,27% Предлагаемый способ обеспечивает в 5 раз большую чувствительность количественного определения ФК, чем в способе-прототипе (метод Васьковского) и в 48 раз быстрее метода прототипа; метод Васьковского занимает 7-8 ч, предлагаемый способ занимает 10 мин.

Приготовление раствора красителя и некоторые пояснения:
Навеску красителя Victoria Blue R (VBR, фирмы Aldrich Chemical Co, Inc. (Wisconsin), из расчета 13,5 мг красителя на 100 мл насыщенного раствора мочевины в воде (предельная растворимость красителя) растворяют в течение 3-4 ч на магнитной мешалке и затем оставляют на ночь без перемешивания при комнатной температуре.

Как было установлено экспериментально, при проведении данного способа можно использовать и меньшие концентрации краски (от 2-12 мг красителя на 100 мл насыщенного раствора мочевины в воде), однако при этом чувствительность метода снижается пропорционально уменьшению концентрации красителя. Таким образом, выбор концентрации красителя 13,5 мг/100 мл обусловлен предельной растворимостью данного красителя, обеспечивающей максимальную чувствительность предлагаемого способа в этом варианте его выполнения.

П р и м е р. Для определения активности ФЛ-D в качестве субстрата используют озвученные (УЗДН, 22 кГц 3 мин) везикулы ФХ (5 мг/мл), приготовленные в трис-HCl буфере (50-100 мМ, рН 7,4) и фермент ФЛ-D), полученный из гомогената кочерыжек капусты с последующей очисткой фермента на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой в градиенте NaCl по известному методу.

Инкубационная смесь содержит
озвученные везикулы ФХ (5 мг/мл в буфере при рН 5,6 или 7,4) 50 200 мкл;
фермент ФЛ-D (2-50 ед. в ацетатном буфере, 50-100 мМ, рН 5,6 или в трис-HCl буфере, рН 7,4) 5-100 мкл;
раствор Са²⁺ (150 мМ до конечной концентрации 5-20 мМ);
этиловый эфир (свежеперегнанный) при проведении отдельных экспериментов 150-400 мкл.

Инкубационную смесь, не содержащую раствор фермента, разливают в 4-6 пробирок, установленных в термостате при 30^оС, и реакцию запускают добавкой определенного количества фермента -ФЛ-D. К контрольным пробам (2-3 пробирки) сразу же добавляют двухкратный объем (от объема пробы) изопропанола и прогревают при 95^оС 3 мин или используют второй способ остановки реакции: добавляют 100 мкл 1 н.HCl. Опытные пробы (2-3) инкубируют при 30^оС 10 мин и останавливают реакцию аналогично контрольным пробам. Далее к образцам добавляют по 5 мл хлороформа, смесь интенсивно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 5-10 мин для растворения фосфолипидов. Затем ко всем образцам добавляют по 2,5 мл VBR-реагента (13,5 мг VBR-красителя на 100 мл насыщенного раствора мочевины в воде), образцы тщательно перемешивают и оставляют стоять для расслоения водной и хлороформенной фаз. После расслоения фаз (2-3 мин) верхнюю фазу удаляют шприцем или пастеровской пипеткой на водоструйном насосе. К оставшемуся раствору добавляют по 2 мл этиленгликоля, смесь тщательно перемешивают и оставляют для расслоения фаз на 3-5 мин. Избыток красителя в верхней фазе удаляют отсасыванием на водоструйном насосе и затем измеряют оптическую плотность (А) нижней фазы при 590 нм на спектрофотометре в 1-см кювете или на ФЭК-е в соответствующем режиме.

Далее по калибровочной кривой (чертеж) определяют количество ФК, выраженное в мкмоль за 1 мин и в пересчете на 1 мг белка, определяют удельную активность препарата фермента ФЛ-D.

Использование предлагаемого способа позволяет быстро проводить количественные и качественные определения активности ФЛ-D и обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества:
чувствительность предлагаемого способа в 5 раз выше, чем для способа-прототипа;
время, необходимое для проведения одного определения, составляет около 10 мин, у способа-прототипа около 7-8 ч, т.е. примерно в 50 раз быстрее;
по сравнению с общепринятыми способами предлагаемый способ позволяет в 16 раз быстрее проводить аналогичные измерения активности ФЛ-D по сравнению с рейнекатным методом, и при этом чувствительность предлагаемого метода примерно в 135 раз выше базового способа. Кроме того, предлагаемый способ не требует специального сложного оборудования.

Назначение: биохимия, может быть использовано в клинической медицине, в микробиологической и пищевой промышленности, при контроле биотехнологических процессов при получении физиологически активных соединений и фосфолипидов. Сущность изобретения: активность фосфолипазы D определяют по количеству фосфатидной кислоты, образовавщейся в результате энзиматического расщепления фосфатидилхолина фосфолипазой D. Расщепление фосфатидилхолина осуществляют путем обработки проб красителем Viktoria Blua R в водном насыщенном растворе мочевины. Окрашенный комплекс фосфатидной кислоты подвергают разделению на фазы. Количество образовавшейся фосфатидной кислоты осуществляют спектрофотометрически в органической фазе. 1 ил.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ Д, предусматривающий проведение ферментативной реакции расщепления фосфатидилхолина с последующей регистрацией количества образовавшейся фосфатидной кислоты, коррелирующего со значением активности фосфолипазы D, отличающийся тем, что ферментативную реакцию расщепления фосфатидилхолина проводят путем обработки проб раствором красителя Victoria Blue R в водном насыщенном растворе мочевины с последующим разделением фаз, причем количество образовавшейся фосфатидной кислоты регистрируют в органической фазе спектрофотометрически.