Способ получения 1,2-диацил-S @ -глицерина Советский патент 1991 года по МПК C12P7/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения 1,2-диацил-Зп-глицерина (ДАГ) из фосфатидилхолина (ФХ) природного происхождения.

Цель изобретения - упрощение способа получения ДАГ.

Способ заключается в обработке фосфатидилхолина фосфолипазой С из Bacillus cereus ВКПМ В-2492, иммобилизованной на силикагеле, в среде этанола с последующим выделением целевого продукта промывкой силикагеля хлороформом. Способ обеспечивает получение 1,2-диацил-Зп-глицерина почти с количественным выходом.

Получение ДАГ по предлагаемому способу осуществляется следующим образом.

,

RjCOO-Cll

фОСФОЛИПОЮ С

LRjCOO-CII

CH2-OCORi

I

С11г-0-Р-О СНг)(С113)з

о

+HO-P-0(CH,)2N

СИ,-ОН

фосфатидилхолин

где RI, R2 - остатки жирных кислот.

Фосфолипазу С инкубируют в верона- ловом буфере с силикагелем. После отделения от буфера иммобилизованный фермент переносят в раствор фосфатидилхолина в этаноле (96%). Образовавшийся ДАГ выделяют путем промывки силикагеля хлороформом. Выход целевого продукта 92-94%.

П р и м е р. В работе использованы 10%-ный яичный фосфатидилхолин, выпускаемый Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов, препарат фосфолипазы С (фосфатидилхоО

ел о

ь

00

со

лин-холинфосфогидролазы, К.Ф.3.1.4,3) из Bacillus cereus ВКПМ В-2492 в 0,01 М веро- наловом буфере, содержащем 0,001 М ZnCIa, выпускаемый НПО Фермент (Вильнюс) с удельной активностью 280 ед/мг.

1 мл препарата фосфолипазы С (120 ед) инкубируют с 1 г силикагеля L 40/100 (ChemafcH ЧССР) в течение 1 сут при 4°С. Через 1 сут на силикагеле связывается до 35% активного фермента. После отделения буфера полученную иммобилизованную ФЛС смешивают с 0,5 мл раствора 56 мг Ф в 96% этаноле и инкубируют 3 ч при 37°С, После этого всю реакционную смесь переносят на стеклянный фильтр № 4 (пор. 16) и удаляют этанол, содержащий фосфохолин, Силикагель на фильтре промывают хлороформом (3x5 мл), Соединенные промывки экстрагируют водой для удаления остатков фосфохолина. Полученный раствор ДАГ в хлороформе упаривают и досушивают при 30°С в вакууме. Получено 42 мг ДАГ (93%). Содержание фосфора в продукте реакции 0,4 мкг/мг, что соответствует содержанию ФХ не более 0,8%. Rf 0,65 на силуфоле UV- 254 в системе петролейный эфир - эфир 1:2. Силикагель с фильтра, содержащий иммобилизованную ФЛС, предварительно промытый этанолом,- водой и вероналовым буфером, пригоден для повторного использования.

В таблице представлены примеры получения ДАГ по предлагаемому способу при различной концентрации ФХ и температуре процесса.

Предлагаемый метод является новым способом получения ДАГ из наиболее доступного природного фосфоглицерида-фос- фатидилхолина. Благодаря обнаруженной

высокой каталитической активности, иммобилизованной на силикагеле фосфолипазы С из В,cereus, проявляемой в этаноле, удалось получить с высоким (почти количественным) выходом оптически активный ДАГ, При применении синтетических приемов выход оптически активного ДАГ составляет 10-35%.

Применение иммобилизованной ФЛС в

среде спирта позволяет получить нужное вещество в одну стадию и существенно упростить его выделение, используя минимальное количество растворителей. Используемые реагенты - фосфатидилхолин и фермент фосфолипаза С из В, cereus - являются легкодоступными и производятся в СССР.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно упростить и удешевить метод получения оптически активного ДАГ,

Формула изобретения

1.Способ получения 1,2-диацил-5п-гли- церина путем ферментативного расщепления фосфатидилхолина фосфолипазой С с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, используют фосфатидилхолин фосфолипазу С из Bacillus cereus ВКПМ В-2492, иммобилизованную на силикагеле, и процесс ведут в этаноле при температуре 35-38°С и концентрации фосфатидилхолина 7-12%, а выделение целевого продукта осуществляют промывкой сорбента хлороформом.

2,Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что используют 10%-ный раствор фосфатидилхолина.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения 1,2-ди- ацил-Зп-глицерина из фосфатидилхолина (ФХ) природного происхождения. Цель изобретения - упрощение процесса. Способ получения 1,2-диацил-5п-глицерина включает ферментативное расщепление фосфатидилхолина фосфолипазой С из Bacillus cereus ВКПМ В-2492, иммобилизованной на силикагеле. Процесс ведут в этаноле при 35-38°С и концентрации ФХ 7-12 % с последующим выделением целевого продукта с сорбента промывкой хлороформом. 1 з.п.ф- лы, 1 табл.